Особенности развития иммунного ответа в зависимости от уонро - уровень общей неспецифической реактивности организма

ГЛАВА 5
ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УОНРО В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ
Современная система обеспечения иммунологических экспериментов предусматривает определенную стандартизацию лабораторных животных с учетом их генетической однородности, микробиологического статуса, показателей развития и роста, общего состояния здоровья. Как правило, этим ограничиваются требования к используемым биомоделям на стадии их отбора и в ходе опыта. Данный подход явно не учитывает целого ряда факторов эндо- и экзогенной природы, способных оказывать существенное влияние на иммунологическую реактивность организма подопытных животных и, соответственно, на результаты экспериментов. В первую очередь это индивидуальные физиологические особенности, определяющие неспецифическую чувствительность и лабильность иммунной системы организма.

1. Особенности развития иммунного ответа в зависимости от УОНРО

Обобщив результаты выполненных исследований (главы 3, 4), мы определили круг вопросов, требующих дальнейшего экспериментального изучения. При этом целью исследования явилось изучение взаимосвязи УОНРО, гормональной активности коры надпочечников и лабильности иммунологических процессов у животных — продуцентов иммунных сывороток.
В опыт было отобрано 20 кроликов, 10 из которых характеризовались высоким — средним УОНРО (I группа). У всех животных одномоментно произвели забор крови и суточный объем мочи для выполнения биохимических и иммунологических исследований. Результаты эксперимента отражены в таблице 21.
Статистический анализ результатов, проведенный согласно рекомендациям Монцевичюте-Эрингене, выявил достоверность различий между I и II группами относительно содержания 17 ОКС,

1. ОКС, фагоцитарной активности лейкоцитов, а также показал явную тенденцию к различию показателей адаптационных реакций.

Распределение некоторых иммунологических показателей у кроликов в зависимости от уровня общей реактивности
организма

Затем животных иммунизировали экзотоксином возбудителя сибирской язвы, стандартизованным по белку в два цикла. Первый цикл вакцинации проводился внутрикожно, он состоял из 4 инъекций возрастающих доз (4, 5, 6 и 8 мг) антигена в смеси с полным адъювантом Фрейнда, с недельным интервалом между инъекциями. Через 30 дней проводилась внутривенная реиммунизация с дозировкой и кратностью инъекций, аналогичной первому циклу.
Антителообразующую способность у животных после иммунизации оценивали по уровню сывороточных антител в РИД.
В процессе иммунизации установлено, что животные с высоким уровнем общей реактивности организма обладали низкой устойчивостью к возникновению стресс-реакции. Лейкоцитарный показатель у данных кроликов через 30 мин после первой инъекции снизился на 0,23 ед., при уменьшении уровня общих ОКС в плазме крови на 62 мг/л, что, безусловно, свидетельствует о развитии острого стресса. Но в то же время спустя сутки у всех кроликов с высоким уровнем общей реактивности организма произошла нормализация адаптационных реакций в границах тренировки. Необходимо отметить высокую лабильность иммунологических процессов у этих животных в вакцинальный период, что выражалось в активном повышении фагоцитарной активности лейкоцитов при иммунизации (в течение 40 дней до 25 единиц) и резком ее снижении с 21-го дня межциклового периода на 6 единиц. Инъекции максимальных доз антигена сопровождались затяжными стресс-реакциями, из которых удавалось быстро выводить кроликов, увеличивая межинъекционный период и снижая антигенную нагрузку.
Кролики, характеризующиеся средним уровнем общей реактивности организма, отличались стабильной устойчивостью к стрессорным воздействиям при адаптационных реакциях тренировки и активации. Животные этой группы проявляли достаточную лабильность иммунологических процессов (увеличение фагоцитарной активности лейкоцитов достигало 17 единиц за 40 дней) и имели устойчивую динамику антителообразования с максимальным нарастанием титров антител к концу второго цикла при максимальной антигенной нагрузке, предусмотренной схемой иммунизации.
Животные с низким уровнем общей реактивности организма были чрезвычайно устойчивы к развитию стресса, при этом лейкоцитарный показатель стабильно указывал на реакцию тренировки. В вакцинальный период они отличались низкой лабильностью иммунологических процессов, что отражалось в медленном нарастании фагоцитарной активности лейкоцитов (в течение 40 дней до 14 единиц). Кролики характеризовались инертностью развития процессов антителообразования и требовали длительного времени для достижения положительных иммунологических результатов гипериммунизации с максимальными дозами антигена во всех инъекциях.
Проведенные исследования позволили обобщить практический аспект использования животных-продуцентов, отличающихся по уровню общей реактивности организма (табл. 22).
Полученные данные свидетельствуют о наличии тесной взаимосвязи между изучаемыми признаками. При этом подтверждаются выводы Г. Селье [Алякринский Б.С., Степанова С.И., 1985] относительно синтаксических реакций, опосредованных глюкокортикоидами и обеспечивающих состояние пассивной толерантности организма к различным стрессорам.

Особенности функционирования организма кроликов-продуцентов в зависимости от уровня общей реактивности организма при гипериммунизации

В результате выполненных экспериментов установлена четкая взаимосвязь фоновых значений УОНРО с лабильностью и интенсивностью иммунологических процессов, обеспечивающих формирование специфического иммунного ответа к бактериальным антигенам. При этом выявлено, что особи с высоким УОНРО обладают высокой лабильностью иммунологических процессов и способностью к интенсивному антителообразованию в ответ на адекватное антигенное раздражение. С понижением УОНРО снижается иммунологическая лабильность, возрастает толерантность к антигенной стимуляции [Тихонов Н.Г. и др., 1992].
Целью последующих исследований явилось более глубокое изучение физиологических механизмов обеспечения гомеостаза организма при формировании иммунного ответа к антигенам как прокариотного, так и эукариотного происхождения в зависимости от УОНРО. Разрешение данных вопросов позволит использовать в полной мере интегративность УОНРО при решении различных прикладных задач иммунологии.
На первом этапе исследований были изучены закономерности развития антителообразования при использовании антигенов эукариотного происхождения.
Опыты выполняли на 30 белых мышах. По показателю УОНРО их распределили на две противоположные группы — с высоким и низким уровнем. Каждую из этих групп дополнительно поровну разделили на две подгруппы. В качестве антигена использовали вытяжку из остриц, являющуюся сильным иммуногеном для мышей. Животных первых подгрупп иммунизировали подкожно минимальной дозой антигена (1,2 мг белка на 1 кг живой массы), а мышей вторых подгрупп — повышенной дозой антигена (2,4 мг белка на 1 кг живой массы). Через 7 дней произвели взятие крови и методом ИФА определили титры сывороточных антител.
В результате проведенных исследований выявили зависимость специфического антителообразования от УОНРО при иммунизации антигеном эукариотного происхождения (табл. 23).
Таблица 23
Особенности антителообразования к Passalurus ambiguus в зависимости от УОНРО и дозы антигенной нагрузки у мышей

Примечание. Титры АТ приведены в обратных величинах.
Статистическая обработка экспериментальных данных, выполненная методом Монцевичюте-Эрингене, позволила установить достоверность преимущества величин титров антител у животных с низким УОНРО относительно особей, обладающих высоким уровнем общей реактивности организма, в случае применения повышенной антигенной нагрузки Passalurus ambiguus (p < 0,05). При иммунизации мышей пониженной дозой антигена определена обратная зависимость. Наиболее интенсивное антителообразование отмечалось у особей, характеризующихся высоким УОНРО.
Анализ полученных результатов подтверждает взаимосвязи, ранее выявленные на модели прокариотных антигенов. То есть высокую иммунологическую реактивность особей с высоким УОНРО при предъявлении низкой антигенной нагрузки и способность индивидов с низким УОНРО к полноценному иммунному ответу в случае чрезвычайной антигенной стимуляции.
Следующие эксперименты выполнили на кроликах, используя в качестве антигена БСА. Целью опытов явилось подтверждение ранее выявленного преимущества антителообразования у особей, обладающих средним УОНРО, в случае применения оп
тимальных для конкретного вида животных эмпирически установленных иммуногенных доз бактериальных антигенов.
Методом случайной выборки сформировали четыре опытные группы кроликов, по 6 животных в каждой. Затем всех подопытных животных одновременно подкожно иммунизировали БСА. При этом кроликам I группы ввели 4 мг белка на 1 кг живой массы, а животным II, III, IV групп соответственно 8 мг/кг, 12 мг/кг и 16 мг/кг. На 8-е сутки после иммунизации произвели взятие крови и методом ИФА определили титры специфических антител. Максимальный титр антител обнаружили у животных II группы, а минимальный у кроликов IV группы (рис. 16).

Рис. 16. Зависимость антителообразования у кроликов от дозы антигенной нагрузки (БСА)
Таким образом эмпирически установлена оптимальная иммуногенная доза БСА для кроликов породы «советская шиншила».
Затем целенаправленно сформировали три группы кроликов, по 6 особей в каждой, с учетом УОНРО. Всех подопытных животных одновременно подкожно иммунизировали оптимальной дозой БСА (8 мг/кг). На 8-е сутки после введения антигена произвели взятие крови и методом ИФА определили титры специфических антител (табл. 24).

Антителообразование к БСА у кроликов с различным уровнем неспецифической реактивности организма

Статистический анализ полученных результатов, выполненный методом Монцевичюте-Эрингене, выявил достоверное преимущество величин титров антител у животных со средним УОНРО относительно особей с низким УОНРО (р < 0,05) и тенденцию к аналогичному преимуществу относительно индивидов с высоким УОНРО (р < 0,1). Это явилось несомненным подтверждением общебиологической закономерности развития индивидуального иммуногенеза, обусловленного УОНРО, верной для антигенов и прокариотной, и эукариотной природы.
Практическим результатом выявленных закономерностей при использовании прокариотных антигенов, отличающихся низкой иммуногенностью, было предложение по целенаправленному отбору животных — продуцентов иммунных сывороток, характеризующихся высоким УОНРО [Мулик А.Б. и др., 1991].
Остается актуальной проблема получения высокотитражных сывороток к антигенам эукариотного происхождения, обладающим низкой иммуногенностью.
Для изучения влияния УОНРО на формирование специфического иммунного ответа в качестве антигена выбрали споры Coccidioides immitis (слабый иммуноген эукариотной природы). Исследования выполняли на кроликах, предварительно определив у них УОНРО. В опыт отобрали 16 животных, обладающих противоположными значениями УОНРО, сформировав 2 опытные группы. Иммунизацию осуществляли по общепринятой схеме, в два цикла, с неполным адъювантом Фрейнда. Первый цикл

включал в себя 4 подкожных иммунизации, с интервалом 2 дня, разовой дозой антигена 1,0 млрд мк. кл. Через 7 дней после первого цикла провели второй цикл из 6 внутривенных инъекций с интервалом в 3 дня, используя такие же дозы антигена. Спустя 7 дней после иммунизации произвели взятие крови и определили титры сывороточных антител в РИД. При этом положительный результат антителообразования, предусмотренный нормативными требованиями сывороточного производства, предполагает получение титра антител 1:8 и выше. Результаты иммунизации отражены в таблице 25.
Таблица 25
Особенности антителообразования у кроликов с крайними значениями УОНРО при иммунизации антигеном эукариотного происхождения (C. immitis)

В результате исследований установили, что в 90 % случаев от кроликов, характеризующихся высоким УОНРО, можно получить сыворотки с достаточным титром специфических антител. В то же время среди животных с низким УОНРО не выявили ни одного полноценного продуцента. При проведении статистического анализа определили, что величины титров антител у кроликов с высоким уровнем общей реактивности организма достоверно выше, чем у особей с низким УОНРО (р < 0,001).
Таким образом, при иммунизации слабым иммуногеном (фактор малой абсолютной величины воздействия), независимо от природы его происхождения, индивидуум, обладающий высоким УОНРО (фактор повышенной иммунологической чувствительности), имеет преимущество в способности к активному иммуногенезу.
Кроме получения высокотитражных иммунных сывороток, в прикладной иммунологии существуют другие актуальные проблемы. Одной из них является накопление асцита у лабораторных животных в гибридомной технологии. Успех асцитообразования во многом зависит не только от качественных особенностей гибридных клеток (гибридом), но и от физиологического состояния животных-реципиентов. Исходя из этого мы предположили, что особи с высоким УОНРО (повышенной иммунологической лабильностью) способны к более активному асцитообразованию и, видимо, обеспечению благоприятных условий для продукции моноклональных антител.
Для выявления предполагаемой зависимости выполнили экспериментальные исследования. В качестве биомоделей использовали линейных мышей ВАLB/c и клон гибридомы В8, продуцирующий моноклональные антитела к возбудителю мелиоидоза. Животных распределили в две опытные группы, отличающиеся крайними значениями УОНРО, по 20 особей в каждой. Затем одновременно всем подопытным мышам внутрибрюшинно ввели по 3 х 10 клеток гибридом в 0,5 мл 0,15 М раствора NaCl. В качестве праймирующего агента использовали неполный адъювант Фрейнда. Контрольными показателями служили сроки, количество и качество получаемого асцита (табл. 26).
Таблица 26
Результаты асцитообразования у мышей BALB/c в зависимости
от УОНРО

Примечание: Титры АТ приведены в обратных величинах.
В результате экспериментов было установлено, что у животных с низким УОНРО сроки получения асцита в среднем на треть короче, а его объем на 40 % больше, чем у мышей, отличающихся высоким УОНРО. При этом статистическая обработка, выполненная методом Монцевичюте-Эрингене, позволила выявить достоверное превышение величин титров антител в группе животных с высоким УОНРО как в реакции ТИФМ (р < 0,001), так и в реакции НМФА (р < 0,002).
Таким образом, следует считать целесообразным в гибридомной технологии при получении асцитической жидкости с моноклональными антителами использовать животных с высоким УОНРО.
Отдельной проблемой прикладной иммунологии является оценка специфической активности вакцинных препаратов на биопробных животных.
Изучение специфической активности вакцинных препаратов включает определение их иммуногенности, выявляемой по величине титров антител при иммунизации животных, а также протективности, устанавливаемой по выживаемости вакцинированных животных при последующем заражении их тест-культурой вирулентного штамма соответствующего возбудителя. Предназначенные для контрольного заражения дозы тест-культур должны строго соответствовать LD50, а в некоторых случаях — MLD. Объективное определение летальных доз для конкретных возбудителей сопряжено с некоторыми трудностями, обусловленными индивидуальными особенностями биопробных животных. Кроме того, чувствительность особей, используемых в предварительных опытах по определению летальных доз, должна строго соответствовать чувствительности индивидов, используемых при постановке контроля вакцинных препаратов. С учетом наличия определенной зависимости индивидуальной резистентности биопробных животных к бактериальному заражению от величины УОНРО были проведены следующие исследования.
Опыты выполнялись на 60 золотистых хомячках. Животных по величине УОНРО разделили на 3 опытные группы по 20 особей в каждой. Дополнительно каждую группу методом случайной выборки разделили на 4 подгруппы. Затем одновременно, внутрибрюшинно, произвели заражение всех хомячков возбудителем сапа. При этом животным первых подгрупп каждой груп
пы ввели в среднем 160 мк. кл.- вторых подгрупп — 80 мк. кл.- третьих — 30 мк. кл.- четвертых — 10 мк. кл. В дальнейшем ежедневно производили учет павших животных.
В результате проведенных исследований были установлены определенные особенности выживаемости золотистых хомячков в зависимости от величины УОНРО и дозы заражения. В первых подгруппах погибли все животные (доза заражения 8LD50). Средняя продолжительность жизни особей с высоким УОНРО (I группа) составила 7,0±0,0 сут. У животных, обладающих средним УОНРО (II группа), этот показатель находился на уровне 6,4±0,6 сут. А у индивидов с низким УОНРО средняя продолжительность жизни составила 4,8±0,2 сут (рис. 17).

Рис. 17. Динамика гибели золотистых хомячков в зависимости от величины общей неспецифической реактивности организма при заражении Pseudomonas mallei дозой 8LD50
Гибель животных во второй подгруппе I группы отмечалась в 60 %, а в аналогичных подгруппах второй и третьей групп — 100 %. В третьих подгруппах первой и третьей групп пало 60 %, а в третьей подгруппе второй группы погибло 80 % хомячков. В четвертых подгруппах гибель наблюдалась преимущественно среди животных первой группы, и она находилась на уровне 40 %, в то время как во второй и третьей группах пало по 20 % особей (рис. 18).

Рис. 18. Выживаемость золотистых хомячков в зависимости от УОНРО при заражении различными дозами Pseudomonas mallei
Таким образом, было установлено, что от высоких доз заражения возбудителем сапа в первую очередь погибают особи, характеризующиеся средним и низким УОНРО, и гибель их отмечается в более короткие сроки. В то же время индивиды, отличающиеся высоким УОНРО, проявляют большую устойчивость к высоким дозам заражения. При заражении низкими дозами возбудителя сапа в первую очередь погибают животные с высоким УОНРО.
Полученные результаты позволяют рекомендовать учет величины УОНРО при отборе биопробных животных, используемых в опытах по бактериальному заражению при определении вирулентных свойств культур.
Следующий этап исследования был посвящен изучению влияния УОНРО на точность и объективность определения специфической активности вакцин по величине протективного эффекта при заражении иммунных животных.
Работу проводили на 150 белых мышах, подобранных по УОНРО и распределенных в три группы. В первую группу вошли особи с высоким УОНРО, во вторую — со средним, а в третью

1. с низким. Животных каждой из групп методом случайной выборки дополнительно разделили на три опытные (по 10 особей) и четыре контрольные (по 5 особей) подгруппы. Затем мышей опытных подгрупп одновременно подкожно иммунизировали чумной живой вакциной в дозе 30 тыс. мк. кл. Через 20 суток у них в ИФА определяли титры специфических сывороточных антител. Средние арифметические значения титров в первой группе составили 1 : 440, во второй группе — 1 : 725 и в третьей группе
2. 1 : 606, что подтверждает оптимальность величины антигенной нагрузки. На следующие сутки произвели одновременное заражение всех экспериментальных животных вирулентным штаммом чумного микроба (J. pestis, штамм — 231). Дозы заражения мышей четырех контрольных подгрупп каждой группы составили 1 х 102, 1 х 103, 1 х 104, 1 х 105 мк. кл., а животных трех опытных подгрупп каждой группы — 1 х 103, 1 х 104, 1 х 105 мк. кл. После заражения наблюдали за интенсивностью гибели животных.

В результате было установлено, что в контрольных подгруппах (интактные животные) сохранилась та же тенденция, что и в опытах на золотистых хомячках, а именно при максимальной
дозе заражения (1 х 105) пали все мыши, но средняя продолжительность жизни животных первой группы составила 3,4±0,30 сут, второй группы — 3,0±0,00 сут, а третьей группы — 2,6±0,30 сут. При минимальной дозе заражения (1 х 102) была отмечена самая низкая продолжительность жизни павших особей в первой группе — 3,6±0,80 сут, в то время как продолжительность жизни животных второй и третьей групп равнялась соответственно 5,3+1,36 и 7,0+1,44 сут (табл. 27).
Таблица 27
Продолжительность жизни белых мышей при заражении различными дозами возбудителя чумы в зависимости от величины УОНРО

Примечание. За контрольную группу условно приняли животных с высоким УОНРО.
Выживаемость мышей опытных подгрупп оказалась в прямой зависимости от величины титров специфических антител и находилась на достаточно высоком уровне у животных второй (70 %) и третьей (60 %) групп (рис. 19).

Рис. 19. Зависимость выживаемости белых мышей от УОНРО в поствакцинальный период при контрольном заражении различными дозами возбудителя чумы Статистический анализ полученных результатов, выполненный с применением t-критерия Стьюдента, выявил тенденцию к преимущественной гибели биопробных животных первой группы относительно особей второй (р <0,1) и третьей (р < 0,25) групп при контрольном заражении.
Кроме этих исследований, по аналогичной схеме были выполнены опыты на 54 морских свинках. Животных предварительно с учетом УОНРО разделили на три группы, по 18 особей. Каждую группу методом случайной выборки поровну распределили в три подгруппы (одна контрольная и две опытные). Жи-
вотных опытных подгрупп одновременно подкожно иммунизировали чумной живой вакциной в дозе 500 мк. кл. Через 20 дней у них взяли кровь и в РПГА определили титры сывороточных специфических антител. При этом средние арифметические значения титров антител в первой группе равнялись 1 : 108, во второй — 1 : 92, а в третьей — 1 : 233. На 21-й день всех морских свинок опытных и контрольных подгрупп одномоментно заразили вирулентным штаммом чумного микроба (J. pestis — штамм 231). Доза заражения для животных контрольных подгрупп составила 1 х 104 мк. кл., а для опытных подгрупп каждой группы

1. 1 х 106 и 1 х 107 мк. кл.

Результаты эксперимента подтверждают наличие ранее установленной зависимости продолжительности жизни зараженных интактных животных возбудителем чумы в дозе, равной DCL, от величины УОНРО (табл. 28).
Таблица 28
Особенности выживаемости биопробных животных в зависимости от величины УОНРО при определении специфической активности чумной живой вакцины

Примечания.
* Титры АТ определялись методом ИФА. ** Титры АТ определялись в РИГА.
Морские свинки первой группы жили в среднем 8,8+1,17 сут, второй группы — 7,5+0,28 сут, а третьей — 3+0,56 сут. Выживаемость опытных (иммунных) подгрупп зависела от величины титров специфических антител в поствакцинальном периоде. При этом максимальная выживаемость наблюдалась у особей третьей группы (67 % при дозе 1 х 106 и 33 % при дозе 1 х 107 мк. кл.). Минимальная выживаемость была отмечена у животных второй группы (33 % при дозе 1 х 106 и 17 % при дозе 1 х 107 мк. кл.).
В целях подтверждения выявленных закономерностей дополнительно выполнили исследования на белых мышах, используя для иммунизации химическую туляремийную вакцину.
Всего в опыт отобрали 48 животных, которых затем разделили на три группы с учетом УОНРО (по 16 животных). Каждую группу методом случайной выборки дополнительно поровну разделили на опытную и контрольную подгруппы. Животным опытных подгрупп одновременно подкожно ввели химическую туляремийную вакцину в дозе 100 мкг. Через 20 дней у них взяли кровь и определили в ИФА уровень сывороточных антител. Средняя величина титров антител по группам была следующей: у животных первой группы — 1 : 400, второй — 1 : 3200 и третьей группы — 1 : 8133. На 21-й день всех животных опытных и контрольных подгрупп одномоментно заразили вирулентным штаммом возбудителя туляремии в дозе 5 х 103 мк. кл. (расчетная 5 LD50).
В ходе опытов была доказана ранее выявленная зависимость. Так, продолжительность жизни животных контрольных подгрупп в первой группе составила 8,7+1,30 сут, во второй группе — 8,5+1,26 и в третьей группе — 8,2+1,15 сут. Выживаемость белых мышей в опытных подгруппах оказалась в прямой зависимости от величины титров специфических антител (рис. 20).

Рис. 20. Динамика ноцицептивной реактивности у кроликов в зависимости от УОНРО в процессе гипериммунизации при средней антигенной нагрузке (Ps. pseudomallei)
При этом в первой группе пало 75 % особей, во второй группе — 43 % и в третьей группе — 17 % животных. Статистический анализ результатов контрольного заражения животных опытных подгрупп, выполненный по t-критерию Стьюдента, выявил достоверное (р < 0,05) увеличение их выживаемости в третьей группе по сравнению с выживаемостью животных первой группы (табл. 29).

Особенности выживаемости иммунных белых мышей в зависимости от величины УОНРО при заражении возбудителем туляремии

Примечания.

1. За контрольную группу условно приняли животных с низким УОНРО.
2. Титры АТ представлены в обратных величинах.

Таким образом, обобщая результаты экспериментов, направленных на выявление взаимосвязи УОНРО с закономерностями выживаемости при заражении животных вирулентными штаммами возбудителей чумы и туляремии, а также особенностями обеспечения специфической защиты организма, необходимо отметить, что особи с высоким УОНРО обладают пониженной резистентностью к низким и повышенной устойчивостью к высоким дозам бактериального заражения. Индивиды, характеризующиеся низким УОНРО, наиболее резистентны к низким и наименее к высоким дозам микробного воздействия. Животные со средним УОНРО занимают промежуточное положение по чувствительности как к высоким, так и к низким дозам заражения. После иммунизации зависимость выживаемости биомоделей от УОНРО при заражении обусловлена особенностями антителообразования. Антителообразование, в свою очередь, также находится в определенной зависимости от УОНРО иммунизируемых животных.