Особенности развития специфических реакций при некоторых токсических и фармакологических воздействиях - уровень общей неспецифической реактивности организма

ГЛАВА 4
ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ НЕКОТОРЫХ ТОКСИЧЕСКИХ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УОНРО
Основную, обязательную и большую по объему часть токсикологических и фармакологических исследований, связанных с изучением взаимодействия веществ и живых организмов, составляет проведение экспериментов на животных [Батрак Г.Е., Кудрин А.Н., 1979]. Фармакологическую активность исследуемых веществ принято характеризовать количественными категориями и качественными реакциями организма на их введение. При этом, как правило, учитывают видовые, возрастные и половые особенности животных, используемых в токсикологических и фармакологических исследованиях [Березовская И.В., 1993- Лоскутова З.Ф., 1980]. Некоторые авторы предлагают дополнительно учитывать физиологическое состояние подопытных животных (стадии полового цикла, режимы кормления), их микробиологический и генетический статус, сезонность, время суток выполнения экспериментов, считая, что только при наличии этих сведений можно судить о воспроизводимости и сопоставимости получаемых результатов [Березкин М.В., 1989].
Несмотря на несомненную значимость обсуждаемых условий обеспечения токсикологических и фармакологических экспериментов, ряд факторов, способных оказывать существенное влияние на результаты опытов, остается неучтенным. О различной чувствительности отдельных людей и животных к одинаковым дозам вводимых веществ, а также достижении однообразных эффектов у различных индивидов при применении доз, отличающихся в несколько раз, известно давно [Холодов Л.Е., Лильин Е.Т., 1980]. Однако даже современной регламентацией проведения данных исследований не предусматривается дополнительное дифференцирование подопытных животных по уровню общей реактивности [Березовская И.В., 1993]. Игнорирование этого факта препятствует правильному выбору адекватно реагирующих групп животных, выявлению контрольных доз испытуемых веществ, объективной оценке ответных реакций и, следовательно, достоверным окончательным выводам экспериментальной работы.

1. Проявление острой и подострой токсичности в зависимости от УОНРО

Токсикологические исследования проводятся с целью выявления неблагоприятного действия химических веществ и биологических препаратов на живой организм. Вакцинное и сывороточное производство требует специфического контроля биопрепаратов с использованием бактериальных токсинов, обладающих заданной активностью. Как правило, предполагается определение острой и подострой токсичности с выявлением летальных, переносимых и действующих доз. Для соблюдения стандартности обеспечения токсикологического эффекта первостепенное значение имеет подбор максимально однотипно реагирующих особей в опытные и контрольные группы. С учетом выявленной интегративности УОНРО и возможности влияния данного показателя на степень выраженности токсикологических реакций нами были выполнены соответствующие исследования.
Первый опыт осуществляли на 30 золотистых хомячках, смоделировав острое химическое токсическое воздействие при помощи йода (Iodum). Животных предварительно дифференцировали по УОНРО, сформировав 3 опытные группы, по 10 особей в каждой. Иод вводили одновременно всем подопытным животным однократно подкожно в дозе 720 мг/кг (DCL) в виде 10 %-го спиртового раствора. Затем ежечасно в течение суток проводили индивидуальный учет павших животных.
В результате эксперимента установили определенную зависимость продолжительности жизни животных от УОНРО. Средняя продолжительность жизни индивидов с высоким УОНРО составила 7,8±2,6 часа, со средним — 10,5+2,96 и с низким — 12,4+2,84.
Статистический анализ полученных результатов, выполненный методом Монцевичюте-Эрингене, выявил тенденцию к достоверности различий продолжительности жизни хомячков между группами животных с высоким и низким УОНРО (р < 0,25).
Второй опыт выполняли на 18 белых крысах, предварительно поровну распределенных в три опытные группы с учетом УОНРО. Острое токсическое воздействие моделировали путем внутрибрюшинного введения всем подопытным животным сальмонеллезного эндотоксина (Salmonella typhimurium) в разовой дозе 15 мг/кг (LD95). Затем ежечасно в течение суток проводили индивидуальный учет павших животных.
В результате эксперимента была установлена зависимость продолжительности жизни подопытных крыс от УОНРО. Срок гибели животных, характеризующихся высоким УОНРО, составил 13,3+2,37 часа. Для белых крыс, отличающихся средним УОНРО, он составил 16,3+2,74 часа. Срок гибели животных с низким УОНРО равнялся 19,2+2,24 часа, при этом две особи в данной группе остались живы (рис. 12).

Рис. 12. Динамика гибели белых крыс при воздействии сальмонеллезного эндотоксина в LD95 в зависимости от УОНРО
Статистический анализ полученных результатов, выполненный с применением критерия Вилкоксона — Манна — Уитни, показал достоверность различий сроков гибели экспериментальных животных, относящихся к крайним группам по УОНРО (р < 0,05).
Третий опыт выполнили на 48 морских свинках, предварительно поровну распределенных в три опытные группы с учетом УОНРО. Для моделирования острого токсического воздействия также использовали эндотоксин S. typhimurium, вводя его одновременно всем подопытным животным внутрибрюшинно в DCL. На протяжении последующих суток ежечасно проводили индивидуальный учет павших животных.
В результате исследования установили зависимость устойчивости экспериментальных животных к предъявленному токсическому воздействию от индивидуального УОНРО. При этом продолжительность жизни морских свинок после введения токсина составила в группах с высоким УОНРО — 13,8+1,79 часа, со средним — 14,6+1,51 часа и с низким УОНРО — 17,6+1,73 часа (рис. 13).

Рис. 13. Динамика гибели морских свинок при воздействии сальмонеллезного эндотоксина в DCL в зависимости от УОНРО
Статистическая обработка данных, выполненная методом Монцевичюте-Эрингене, выявила тенденцию к достоверности различий показателя продолжительности жизни между группами животных с высоким и низким УОНРО (р < 0,25). Таким образом, обобщив экспериментальные данные, можно сделать заключение о влиянии УОНРО на индивидуальную устойчивость к острому токсическому воздействию, независимо от природы токсина. Причем наибольшей устойчивостью отличаются особи с низким УОНРО, а наименьшей — с высоким УОНРО. Индивиды, обладающие средним УОНРО, характеризуются промежуточным положением в устойчивости к токсинам между крайними группами животных, фактически отражая среднепопуляционный токсикологический эффект.
Кроме контроля острой токсичности, в практике токсикологических исследований широко используют оценку подострой токсичности. При этом степень токсичности определяют по выраженности реакции организма на введение исследуемого вещества, имеющей для него неблагоприятное значение [Батрак Г.Е., Кудрин А.Н., 1979].
Оценку подострой токсичности микробных токсинов наиболее часто проводят по результатам «питьевой пробы». Метод исследования основан на проявлении действия бактериальных токсинов, обусловливающих снижение живой массы биопробных животных. В качестве биомодели используют мышей. Непосредственно перед введением препарата определяют живую массу опытной и контрольной групп животных. Исследуемый препарат вводят внутрибрюшинно и в течение недели наблюдают за динамикой изменения массы мышей опытной группы. Чем выше отставание живой массы у мышей опытной группы от животных контрольной группы, тем выраженнее степень токсичности изучаемого препарата.
Учитывая влияние УОНРО на устойчивость организма к острому токсическому воздействию, мы предположили, что и реакция на подострое токсическое воздействие так или иначе будет зависеть от индивидуального УОНРО.
Для изучения зависимости изменения живой массы биопробных животных от УОНРО при подостром токсическом воздействии выполнили соответствующие исследования.
Работу проводили на 60 белых мышах, подобранных по возрасту (55—65 дней) и живой массе (17,0—19,0 г). Кроме того, животные были дифференцированы с учетом УОНРО и поровну распределены в три группы. В I группу вошли особи с высоким, во II группу — со средним, а в III группу — с низким УОНРО. Каждую группу мышей дополнительно разделили на две подгруппы, опытную и контрольную, по 10 особей. Формирование подгрупп производили за 6 суток до опыта (рекомендуемый период адаптации). В этот период средняя масса животных I группы снизилась на 0,1 г, масса мышей II группы осталась неизменной, а в III группе увеличилась на 1,5 г. На 7-е сутки всем животным опытных подгрупп одномоментно внутрибрюшинно вводили МДД (10 мг/кг) стафилококкового экзотоксина (S. aureus). Одновременно всем мышам контрольных подгрупп аналогичным образом вводили соответствующий объем физраствора. Затем ежедневно в последующие 7 суток производили взвешивание каждой подгруппы животных.
В результате экспериментов выявили определенные особенности динамики живой массы мышей опытных и контрольных подгрупп в зависимости от УОНРО.
С момента инъекций масса животных опытной подгруппы I группы снизилась ко вторым суткам в среднем на 1,5 г, затем держалась на одном уровне, на четвертый день начала возрастать, а к концу недели ее дефицит составил в среднем 0,5 г от исходного уровня. Живая масса мышей опытных подгрупп II группы за время опыта возросла в среднем на 1,2 г, а III группы — на 1,5 г (рис. 14).
Во всех контрольных подгруппах наблюдали устойчивое повышение массы животных. При этом масса мышей I группы превысила исходный уровень на 0,5 г, а II и III групп практически совпала со значениями соответствующих опытных подгрупп.
Таким образом установили, что животные, характеризующиеся высоким УОНРО, отличаются повышенной чувствительностью к подострому токсическому воздействию, определяемому методом «питьевой пробы».

Рис. 14. Динамика изменения живой массы белых мышей, распределенных по УОНРО, до и после воздействия МДД стафилококкового экзотоксина Кроме использования «питьевой пробы», для оценки подострой токсичности нередко применяют анализ морфологических изменений, характерных для патологических процессов, вызываемых токсическим воздействием.
Для изучения влияния УОНРО на изменение массы внутренних органов при подостром токсическом воздействии выполнили следующие исследования.
В качестве биомодели использовали 36 морских свинок. Животных с учетом индивидуального УОНРО поровну распределили в три группы. Каждую из групп дополнительно, методом случайной выборки, разделили на опытную и контрольную подгруппы, по 6 особей. Подострое токсическое воздействие моделировали путем трехкратного, с часовым интервалом, внутрибрюшинного введения МПД (0,5 мг/кг) сальмонеллезного эндотоксина (S. typhimurium) животным опытных подгрупп. Одновременно морским свинкам контрольных подгрупп вводили соответствующий объем физраствора по аналогичной схеме. Спустя 10 часов осуществляли одновременную эвтаназию всех экспериментальных животных путем декапитации. Произведя аутопсию, извлекли печень, легкие, сердце, селезенку, почки и надпочеч-
ники. Затем извлеченные органы взвесили и рассчитали их массовую долю в индивидуальном порядке.
В результате экспериментов установили определенную тенденцию к изменениям относительной массы некоторых внутренних органов при подостром токсическом воздействии (табл. 17).
Таблица 17
Изменение относительной массы внутренних органов у морских свинок в зависимости от УОНРО при воздействии МПД сальмонеллезного эндотоксина

* Статистически достоверное изменение (р < 0,05) по критерию Вилкоксона — Манна — Уитни.
При этом по причине значительных величин статистических ошибок рассчитанных средних арифметических показателей достоверных изменений относительной массы внутренних органов, за исключением надпочечников, не выявлено. Однако полученные результаты позволяют констатировать, что в большей степени морфологическим изменениям внутренних органов, характерным для интоксикации, подвержены особи с низким УОНРО.
Полученные результаты позволяют в значительной степени оптимизировать оценку подострой токсичности за счет целенаправленного подбора биомоделей с заданным УОНРО. Однако определение пороговых доз токсических веществ остается проблематичным по причине отсутствия методов качественной оценки данного показателя.
Предположив, что у самок с высоким УОНРО репродуктивная система окажется относительно более чувствительной к пороговой величине интоксикации, мы предприняли исследования, позволяющие надеяться на выявление показателей качественной оценки МДД токсического воздействия. Работу выполняли на белых мытах — виде животных, имеющем полиэстральный тип половой цикличности со спонтанной овуляцией. Всего в опыте использовали 198 мышей (162 + 36), предварительно дифференцированных с учетом УОНРО и поровну распределенных в три группы. I группа включала в себя особей с высоким УОНРО, II — со средним и III — с низким. Каждая группа состояла из трех равных подгрупп, двух опытных (А и В) и одной контрольной. Каждая подгруппа, в свою очередь, комплектовалась из двух семей (по 6 + 2) и одной однополой (6) минигруппы. Все семьи опытных А-подгрупп формировались непосредственно после подкожного введения самкам сальмонеллезного эндотоксина в расчетной МДД (0,4 мг/кг в 0,2 мл 0,9 %-го раствора NaCl). Все семьи опытных В-подгрупп формировались на 7-е сутки после аналогичного токсического воздействия.
Животные однополых минигрупп подвергались токсическому воздействию одновременно с самками своих подгрупп, с целью учета возможного влияния времени инъекций на чувствительность организма к эндотоксину. Все самки контрольных подгрупп, как в семьях, так и в минигруппах, подвергались воздействию плацебо (0,9 %-й раствор NaCl). Формирование семей опытных (А и В) и контрольных подгрупп всех групп производилось одновременно, при варьировании сроков введения токсина. На 14-е сутки с момента формирования семей всех самок первых контрольных и опытных подгрупп А и В усыпили эфиром и забили путем смещения шейных позвонков. Затем произвели аутопсию, извлечение матки и после вскрытия ее рогов определили эмбриональную смертность. У всех самок вторых контрольных и опытных подгрупп А и В с 20-х по 30-е сутки с момента формирования семей ежедневно фиксировали появление приплода.
В ходе эксперимента у всех самок однополых минигрупп производили ежедневный учет половой цикличности.
В результате выполненных исследований установлены следующие принципиальные моменты.
У 70 % самок I группы опытных минигрупп в подгруппах А и В на 4—6-е сутки после токсического воздействия развивалась анафродизия (прекращение половых циклов). У 50 % животных III группы опытных минигрупп в подгруппах А и В в те же сроки наблюдалась активация репродуктивной сферы (овуляция в отсутствие самца).
В первой опытной А-подгруппе I группы у самок при вскрытии матки выявлено полное отсутствие эмбрионов. В аналогичных подгруппах II и III групп наблюдали полноценное развитие беременности (табл. 18).

Показатели эмбриональной гибели у самок белых мышей в зависимости от УОНРО при воздействии МДД сальмонеллезного эндотоксина

По сравнению с животными первых контрольных подгрупп соответствующих групп эмбриональная смертность в опытных А-подгруппах, кроме I группы, не имела существенных изменений величин исследуемых показателей. Причем у животных III группы опытной А-подгруппы выживаемость имплантировавшихся эмбрионов превышала таковую у особей контрольной подгруппы.
Значения показателей эмбриональной гибели у животных первых опытных В-подгрупп всех групп практически полностью совпали с аналогичными величинами в контрольных подгруппах.
Величины показателей воспроизводства в каждой из групп не имели существенных различий у животных вторых контрольных и вторых В-опытных подгрупп.
Появление приплода во второй А-подгруппе I группы в контрольные сроки зафиксировано не было. Значения показателей воспроизводства во вторых опытных А-подгруппах II и III групп соответствовали аналогичным величинам, полученным в однотипных контрольных подгруппах.
Таким образом, воздействие МДД микробного эндотоксина, оказывая подавляющее действие на функциональную активность репродуктивной сферы самок белых мышей, отличающихся высоким УОНРО, одновременно активирует половую систему особей, характеризующихся низким УОНРО. Временной пик угнетения репродуктивной функции животных с высоким УОНРО приходится на 5-е сутки после однократного токсического воздействия, а полное ее восстановление происходит к 8-м суткам.
Выявленные взаимосвязи позволяют предложить новый показатель качественной оценки МДД токсических веществ бактериальной природы.

Обобщая экспериментальные данные выполненных исследований, можно сделать заключение о несомненном влиянии УОНРО на особенности проявления острой и подострой токсичности у лабораторных животных. Причем, выполняя оценку подострой токсичности различных веществ, необходимо учитывать специфические моменты развития тех или иных патологических реакций в зависимости от индивидуального УОНРО.