Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия - токсикология полимерных материалов
Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия полимерных материалов и их компонентов. В качестве экспериментальных животных используют обычно мелких млекопитающих — мышей, крыс, хомяков или кроликов (табл. 16). Куриные эмбрионы, морские ежи и другие животные практически не применяются в исследованиях по гигиенической регламентации вследствие невозможности экстраполяции полученных данных на человека в связи с существенными различиями в метаболизме и механизмах детоксикации.
Известно, что выявление эмбриотоксического эффекта возможно не на всех видах животных. Поэтому ВОЗ рекомендует проводить тестирование на тератогенность на 3 видах млекопитающих — крысах, мышах и кроликах. Поскольку число спонтанных уродств у беспородных белых мышей и крыс незначительно, они являются наиболее подходящей биологической моделью для изучения влияния химических веществ на репродуктивную функцию млекопитающих.
При исследовании эмбриотоксических свойств химических веществ большое значение придают режиму их поступления в организм. Л. С. Сальникова и соавторы (1972) считают, что ранее широко рекомендованные критические периоды эмбриогенеза не могут использоваться в полной мере, так как на протяжении всей беременности, в каждый день и час происходит закладка и дифференцировка тканей и органов, повреждение которых чревато серьезными последствиями для плода. В то же время, согласно мнению экспертов ВОЗ (1968), хотя длительное введение препаратов в течение всей беременности представляется логичным, такой режим может изменить его метаболизм в организме матери и замаскировать тератогенное действие.
Уровень воздействия вещества на беременных животных должен приближаться к пороговым дозам и концентрациям по общетоксическому эффекту, в противном случае по изменениям, возникшим в течение эмбриогенеза, нельзя судить о специфике действия изучаемого вещества.
Таблица 18. Величина массы плодов у различных лабораторных животных, г
Таблица 17. Некоторые показатели генеративной функции белых крыс
Для исследования влияния химических веществ на эмбриональное развитие формируют группы с таким расчетом, чтобы на каждую дозу (концентрацию) приходилось в начале эксперимента по 20 самок. Столько же животных должно быть в контрольной группе. Для получения эмбрионального материала самок забивают перед родами (на 19—20-й день беременности), так как нежизнеспособные детеныши могут съедаться самками, что затрудняет учет результатов эксперимента. Половину самок доводят до родов, чтобы иметь возможность проследить за развитием потомства.
При осмотре плодов отмечают наличие видимых аномалий, которым дают качественную и количественную характеристику. Результаты изучения эмбриотоксического и тератогенного действия химических веществ оцениваются на основании макроскопического исследования плодов и учета показателей, характеризующих репродуктивную функцию животных: индекс оплодотворения (количество забеременевших самок / количество оплодотворенных X 100%), количество желтых тел, количество живых плодов на 1 самку, количество плодов, погибших до и после имплантации, процент доимплантационной и постимплантационной гибели в группе, кранно-каудальный размер плодов, масса плодов, наличие грубых аномалий развития, соотношение самцов и самок в помете (табл. 17, 18).
Согласно «Методическим указаниям по изучению эмбриотоксического действия химических веществ при гигиеническом обосновании их ПДК в воде водных объектов» (1984 г.), эмбриотоксическое действие необходимо изучать при наличии сведений об эмбриотоксичности вещества при любом пути его поступления в организм, для веществ, характеризующихся быстрым проникновением через плаценту, влияющих на функцию гонад, для мутагенов, канцерогенов и близких к ним по химическому строению и свойствам веществ, для новых или недостаточно изученных классов химических соединений. При исследовании воздействия химических веществ на эмбриональное развитие млекопитающих руководствуются также «Методическими указаниями по тестированию тератогенной и эмбриотоксической активности новых лекарственных веществ» (1972 г.), «Методами экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования» (1978 г.). Используют метод Вильсона, который требует предварительной фиксации плодов в жидкости Буэна, после чего бритвой производятся поперечные их срезы.
Staples (1974) предложил метод висцерального исследования плодов. При этом внутренние органы плода изучаются in situ в течение 3 мин. При висцеральном исследовании органов плодов матку разрезают по всей длине, с каждого плода удаляют плодные оболочки. Для предупреждения внутриутробных геморрагий пинцетом на 30 с пережимают пуповину у основания, затем над ним перерезают ее пинцетом. В отличие от метода Вильсона отпадает необходимость в двухнедельной предварительной фиксации плодов и исследовании костной системы. Преимуществом описываемого метода, как подчеркивает Л. В. Марцонь (1979), является возможность обнаружения аномалий развития, не выявленных методом Вильсона, т. е. при сокращении сроков повышается эффективность исследований.
Результаты эксперимента оцениваются с учетом указанных выше показателей, а также данных висцерального исследования, исследования головы (по Вильсону) и скелета (по Даусону). Последовательность операций при висцеральном исследовании органов плода изложена в «Методике висцерального исследования плодов лабораторных животных при экспериментах по оценке тератогенной активности химических веществ» (1980 г.). Полученные данные оцениваются на основании статистически значимых (или незначимых) различий у подопытных животных по сравнению с контролем и качественного анализа наблюдаемых эффектов.
При этом, согласно Л. В. Марцонь (1979), необходимо руководствоваться следующими критериями.
- Сильным тератогеном является вещество, вызывающее единичные или множественные морфологические изменения органов у статистически значимого количества плодов (по отношению к контролю) в дозах, нетоксичных или близких к токсическим для материнского организма.
- Тератогенный эффект, обусловленный дозами вещества, токсичными для материнского организма, свидетельствует об отсутствии избирательности указанного действия, а вызвавшие его соединения относят к слабым тератогенам.
- Вещество не является тератогеном, если структурные изменения у плода не обнаружены при воздействии доз, токсичных для материнского организма.
При наличии в составе полимерных материалов веществ, обладающих избирательным тератогенным действием, сфера применения их должна быть строго ограничена. Предпочтительным является замена опасных ингредиентов в материале. Миграция из пластмасс веществ, не обладающих избирательным тератогенным действием, регламентируется с помощью ДУ и ДКМ.
Интегральная оценка влияния на репродуктивную функцию — «тест нескольких поколений» (P. L. Wright, 1978). Данный методический подход позволяет получить интегральную оценку гонадо- и эмбриотоксического, тератогенного и мутагенного действия одновременно. Непрерывная затравка охватывает периоды спермато-, ово- и эмбриогенеза, спаривания и лактации на протяжении жизни нескольких поколений. Основной методический прием — серийное спаривание животных и наблюдение за беременными самками и их потомством.
В качестве экспериментальных животных используют грызунов. Родительское поколение (F0) составляют 10 самцов и 20 самок. Спаривание осуществляют по принципу 1 самец+2 самки. Начало беременности у крыс и хомяков определяют по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке во время стадии эструс, у мышей—по влагалищной пробке. С этого дня начинают затравку родительского поколения (F0) и продолжают до окончания вскармливания детенышей второго поколения. Тем самым обеспечивается воздействие вредного фактора на гонады, начиная со стадии внутриутробного развития гамет.
После достижения половой зрелости животными второго поколения (F1a) их спаривают (15 самцов и 30 самок) и получают третье поколение животных (F2a). 10 беременных самок умерщвляют на 20-й день беременности. Учитывают количество живых плодов, наличие аномалий развития, а также плодов, погибших до и после имплантации. 20 самок оставляют до естественных родов, после чего определяют количество живых и мертворожденных, массу их тела, выживаемость молодняка на 4-й и 21-й дни после рождения.
Схема проведения эксперимента: 
Через 10 дней после окончания вскармливания F2a потомства F1a родительское поколение (20 самок и 10 самцов) вновь спаривают для получения еще одного помета (F2в), у которого учитывают те же самые показатели. Результаты подвергают статистической обработке.
«Тест нескольких поколений» предусматривает значительный объем исследований, что ограничивает его широкое использование. Интегральную оценку гонадо- и эмбриотоксического, а также тератогенного действия можно получить в более сжатые сроки, если принять следующую схему эксперимента, максимально адекватную реальным условиям влияния на население вредных факторов окружающей среды.
Пороговую дозу влияния на репродуктивную функцию устанавливают в результате 3-месячного воздействия вещества (фактора) на самцов и самок крыс, после чего животных спаривают. Затравку самок продолжают также во время беременности. При этом интегральный результат, полученный в эксперименте, будет отражать возможность комбинированного действия вещества на потомство (на половые железы самцов и самок и на развитие плода). Неэффективная доза будет истинно таковой, в отличие от недействующей дозы, полученной в опытах, где используются интактные самцы или самки, спаренные с подвергшимися воздействию животными. Такая модель опыта соответствует задачам гигиенической регламентации и не исключает возможности проведения дополнительных экспериментов по другим схемам, имеющим целью установить точку приложения повреждающего агента (мужские и женские половые железы или плод). Она выгодно приближает к реальности методику изучения эмбриотоксического действия, согласно которой воздействие на самок начинается только с момента зачатия, а возможность предшествующего отравления не учитывается.
