Биохимические и физиологические методики - токсикология полимерных материалов
В настоящее время в токсикологических исследованиях используется около 400 биохимических и физиологических методик. Постоянно расширяющийся и быстро совершенствующийся набор методик в токсикологических экспериментах способствует наиболее раннему выявлению сдвигов в физиологическом и биохимическом статусе организма (М. Л. Рылова, 1964- И. М. Трахтенберг и соавт., 1968- И. В. Саноцкий и соавт., 1970- О. Н. Елизарова, 1971- А. П. Шицкова и соавт., 1977).
Для оценки состояния некоторых органов и систем организма используют комплекс показателей и методик, рекомендуемых «Методическими указаниями по гигиенической оценке новых пестицидов».
Для характеристики функционального состояния печени применяют следующие основные пробы:
- Обезвреживающая функция: проба Квика—Пытеля- длительность гексеналового сна- активность микросомальных оксигенез (по деметилированию амидопирина, гидроксилированию анилина, по динамике выведения с мочой метаболитов амидопирина, по содержанию цитохрома Р-450).
- Экскреторная функция: БСФ-проба.
- Углеводная функция: уровень сахара в крови- характер гликемических кривых при нагрузке галактозой- содержание гликогена в печени.
- Белковая функция: количество общего белка и соотношение белковых фракций в сыворотке крови.
- Пигментная функция: количество билирубина в сыворотке крови.
- Активность печеночных ферментов и ферментов сыворотки крови: аминотрансферазы, сорбитдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатазы, урокининазы, щелочной фосфатазы, изофермента ЛДГ5- холинэстеразы.
Морфологическими критериями гепатотоксичности химических веществ являются (P. S. Guzelian, 1983): острый и подострый некроз печени, холестаз, жировое перерождение, гипертрофия эндоплазматического ретикулума, окклюзионные поражения сосудов печени, грануломы, гепатопортальный фиброз, цирроз, гепато- целлюлярная карцинома, ангиосаркома и др.
Для оценки функционального состояния почек учитывают суточный диурез, содержание хлоридов в моче, а также определяют клиренс мочевины и креатинина, пробу с фенолротом и др.
Для суждения о состоянии симпатоадреналовой системы и обмена серотонина определяют величину экскреции с мочой адреналина, норадреналина, дофамина, винилил-миндальной кислоты— метаболита катехоламинов и 5-ОИУК. — метаболита серотонина.
Функциональное состояние щитовидной железы оценивают с помощью пробы с радиоактивным йодом, функцию коркового вещества надпочечников — по определению в моче содержания 17- кетостероидов, 17-оксикортикостероидов, а в крови—11-оксикортикостероидов.
О характере протекания окислительных процессов свидетельствуют результаты определения потребления кислорода, активности цитохромоксидазы, сукцинат-, лактат-, малатдегидрогеназ, пероксидазы, каталазы, содержания окисленных и восстановленных форм никотинамидных коферментов, глютатиона, уровня молочной и пировиноградной кислот, окси-, карбокси- и метгемоглобина.
С. Н. Голиков (1980) указывает на необходимость изучения проблем химической патологии на основе единой общебиологической концепции, каковой является учение о гомеостазе. Учение о гомеостазе широко используется в общей патологии, но пока еще не нашло систематического развития в токсикологии.
Как отмечают Л. А. Тиунов и соавторы (1980), адекватные биохимические показатели по своей информативности соответствуют, а в ряде случаев превосходят обычные интегральные методы. Авторы считают наиболее предпочтительным использование биохимических показателей, имеющих относительно неспецифический характер и отражающих состояние конкретного метаболического цикла, органа. К числу таких показателей относят, например, цитохром Р-450, В5, НАД- и НАДФ — оксидазные системы микросом, изменение активности которых под влиянием химических веществ приводит к нарушению функционирования редокс-цепей мембран эндоплазматического ретикулума. Как подчеркивает Ю. С. Каган (1981), биологическая значимость состояния этих систем и правомерность использования этих показателей для целей гигиенического нормирования подтверждаются также обнаруженной в эксперименте однонаправленностью изменений, проявляющихся на различных уровнях структурной организации (субклеточном, органном, организменном). Другим неспецифическим показателем является окислительное фосфорилирование в митохондриях, нарушение которого наблюдается не только при действии специфических «разобщающих» ядов, но и самых разнообразных веществ, таких, как мономеры — стирол, фенол, эпихлоргидрин. К числу таких показателей Л. А. Тиунов и соавторы (1980) относят также сывороточные ферменты — аминоферазы, сорбитол- дегидрогеназу, холинэстеразу. Специфические показатели уместно применять при хорошо изученном метаболизме тестируемого соединения.
При исследовании механизмов метаболических ответных реакций организма универсальным и наиболее ранним проявлением, как считают Г. И. Сидоренко и Р. В. Меркурьева (1983), является мембраноповреждающий эффект, интенсивность которого зависит от интенсивности и времени воздействия факторов.
Несмотря на обилие современных биохимических методов, используемых экспериментальной гигиеной, научно-обоснованная их классификация по приоритетности отсутствует. Р. В. Меркурьевой (1982) предложена подобная классификация на основе обобщенных результатов исследований метаболических механизмов мембраноповреждающего воздействия, поиска универсальных закономерностей и критериев оценки защитных реакций организма и перехода адаптационно-приспособительных проявлений в начальные этапы неблагоприятного воздействия. Автор рекомендует биохимические, цитологические и цитохимические методы исследования функционального состояния внутриклеточных органелл (эндоплазматической сети, митохондрий, лизосом), обмена гликоконъюгатов в тканях различных органов и систем (печень, почки, головной мозг, плацента, гонады, альвеолярные макрофаги и др.), а также в биологических жидкостях (сыворотка крови, моча, амниотическая, семенная) для оценки биоэффектов как в эксперименте, так и при обследовании людей (табл. 5, 6, 7).
Нервная система является наиболее вероятной мишенью необратимых воздействий химических агентов. Это действие нельзя объяснить единым механизмом из-за сложных функциональных свойств головного и спинного мозга. Одним из механизмов химической нейротоксичности является способность снизить потребление кислорода клеткой вследствие ингибирования дыхания митохондрий. Токсические влияния на ЦНС кумулируются, особенно при действии металлов.
При исследовании вредного воздействия на организм малых концентраций и доз химических веществ большое значение придают изучению тонких функциональных изменений в ЦНС и поведенческих реакциях. Такой подход основан на предположении И. П. Павлова о том, что ЦНС является функционально интегрирующей системой организма, и изучается она с помощью метода условных рефлексов. Метод условных рефлексов длительное время был одним из основных в исследованиях по гигиеническому нормированию содержания вредных веществ в воде водоемов. Почти все ПДК, установленные по санитарно-токсикологическому признаку вредности, еще 15 лет тому назад выявляли на основании изучения условно-рефлекторной деятельности подопытных животных.
Таблица 5. Классификация биохимических методов (по приоритетности) для исследования функционального состояния эндоплазматического ретикулума при оценке влияния на организм химических веществ (по Р. В. Меркурьевой, 1982)
Для оценки токсического эффекта пригоден также простой, но чувствительный метод определения латентного периода ответной реакции на электрический раздражитель.
В последнее время в токсикологии широко используются поведенческие реакции, которые обладают большей чувствительностью к токсическим воздействиям, чем другие методы. Высокая информативность этого метода объясняется тем, что поведение является функциональным индикатором как чисто сенсорных и двигательных, так и интегративных процессов в центральной и периферической нервной системе. Как отмечают С. L. Mitchel и Н. A. Tilson (1982), трудности использования поведенческих методов в токсикологии обусловлены поиском зависимостей между субъективными ощущениями (жалобами) человека и изменениями в поведении лабораторных животных- выявлением изменений нервной системы- статистическими проблемами в связи с вариабельностью, присущей многим поведенческим реакциям- выбором адекватных поведенческих методов для конкретных токсикологических исследований.
Таблица 6. Классификация биохимических методов (по приоритетности) для исследования функционального состояния митохондрий и процессов энергообеспечения при оценке влияния на организм химических веществ (по Р. В. Меркурьевой, 1982)
Метод | Объект исследования | Биоэффект | Изученный компонент ПМ |
Обязательные | |||
Малатдегидрогеназа | Печень, почки, легкие, головной мозг, плацента, гонады, сыворотка крови | Гепато-, нейро-, | Формальдегид, хром, цинк, свинец |
Лактатдегидрогеназа | Желательные | ||
Сукцинатубихинонре- | Печень, почки, легкие, плацента, гонады | Гепато-, эмбрио-, нейротоксический | Свинец, цинк, хром, формальдегид |
Глутаминатдегидроге- | Факультативные | ||
Протонная АТФ-аза | Митохондрии печени, почек, легких, гонад | Гепато-, общетоксический | Формальдегид, хлоропрен, хром |
Перспективные | |||
Цитохром С | Митохондрии печени | Гепатотоксический | — |
Малоновый диальдегид | Печень, почки, головной мозг Печень, легкие, сыворотка крови | Гепато-, общетоксический, канцероген; | Диметилацетамид, |
Существует мнение, что изменения в макро- и микроструктуре органов и тканей—более серьезная патология, чем изменения функциональные. Хотя это и не всегда так, морфологические исследования часто являются наиболее важным, а иногда и единственным установленным в токсикологическом эксперименте показателем поражения тканей и органов. В экспериментах используются разнообразные методы — от рутинной качественной оценки токсичности до тонких гистохимических методик, авторадиографии, электронной микроскопии, иммунофлуоресцентных и иммуноферментных методов.
Животных умерщвляют обескровливанием (пункция сердца или брюшной аорты), декапитацией, с помощью наркоза (эфиром, барбитуратами). Погибшие животные также подвергаются вскрытию (начинают с наружного осмотра).
Таблица 7. Классификация биохимических методов для исследования функционального состояния лизосом и обмена гликоконъюгатов при оценке влияния химических веществ на организм (по приоритетности- Р. В. Меркурьева, 1982)
Метод | Объект исследования | Биоэффект | Изученный компонент ПМ |
Обязательные | |||
Р-галактозидаза | Печень, головной мозг, гонады, плацента, сыворотка | Гепато-, нейро-, эмбрио-, гонадотоксический | Свинец, хром, хлоропрен, бенз(а)пирен |
Кератансульфат Гексуроновые кислоты | Моча | Общетоксический | Свинец Свинец, хром |
Желательные | |||
Нейраминидаза | Печень, почки, сыворотка крови Печень, головной мозг | Канцерогенный, | Анилин, нитрозодиметиламин |
Факультативные | |||
Индивидуальные представители гликозаминогликанов Скорость биосинтеза глюкозамин-6- фосфата | Печень | Общетоксический | Формальдегид, свинец, хром |
Перспективные | |||
а-4-фукозидаза Катепсины | Мозг | — | |
При исследованиях на пероральную токсичность отбирают следующие органы и ткани: мозг, гипофиз, щитовидную, вилочковую железу, легкие, сердце, грудину, слюнные железы, печень, пищевод, желудок, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную, слепую, толстую, прямую кишки, селезенку, почку, надпочечники, поджелудочную железу, половые железы, наружные половые органы, аорту, желчный пузырь, мочевой пузырь, лимфатические узлы, молочные железы, мышцы, периферические нервы, спинной мозг.
Кроме того, фиксируют все ткани с видимыми поражениями. При оценке ингаляционной токсичности изучают органы дыхательной системы, при исследовании кожной токсичности — участки кожи, подвергшейся воздействию.
Микроскопическая, гистологическая методики, а также авторадиография и электронная микроскопия подробно описаны в специальных руководствах.
Данные макроскопических наблюдений должны коррелировать с результатами микроскопических исследований. Однако информация о функциональных нарушениях, отмеченных в ходе эксперимента, не должна влиять на объективность суждения патоморфолога.
Использование расчетных методов для определения токсичности веществ в нашей стране было предложено Н. В. Лазаревым (1944), который считал целесообразным решать этот вопрос, не применяя эксперимента там, где можно обойтись расчетом или сопоставлением аналогичных данных. Автор разработал проблему связи химических свойств и строения органических соединений с силой и характером их биологического действия.
В последнее десятилетие в нашей стране проведена большая работа по выявлению корреляционных зависимостей менаду величинами гигиенических нормативов и физико-химическими и биологическими параметрами веществ (Г. Н. Заева, 1964- Ю. С. Каган, Л. М. Сасинович, 1970- Е. И. Спыну, Л. Н. Иванова, 1974- Е. Н. Люблина, А. А. Голубев, В. А. Филов, 1976- С. Д. Заугольников и соавт., 1978- Г. Н. Красовский, З. И. Жолдакова, С. А. Шиган, Егорова, 1978- Т. А. Пинигин и соавт., 1978- Б. М. Штабский, 1978- С. М. Новиков, 1984). Развитие исследований в этой области качественно изменило подходы к гигиенической регламентации содержания химических загрязнений в различных объектах окружающей среды. Использование этих приемов правомерно для обоснования новых ДУ и ДКМ.
Как отмечают Б. М. Штабский и соавторы (1981), экспресс- экспериментальные методы радикально изменили роль хронического опыта, сведя ее к проверке правильности оценок, полученных перед началом эксперимента.
Экспрессные и расчетные методы установления гигиенических нормативов можно разделить на три группы.
- Обоснование расчетных нормативов по физико-химической характеристике веществ.
- Экспресс-экспериментальное обоснование безопасных уровней воздействий (ОБУВ) по результатам краткосрочных токсикологических экспериментов.
- Расчетное нормирование веществ в какой-либо среде по уже установленным нормативам и др.
Для расчета токсиколого-гигиенических параметров применяется несколько сот математических уравнений. Большинство уравнений создано на основе применения корреляционного и регрессионного анализа.
Надежность методов ускоренного нормирования определяется уровнем достоверности формул (величины коэффициента корреляции) и характером используемых в них параметров, значение которых возрастает в ряду: физико-химические константы—показатели острой токсичности—величины ПДК в других объектах окружающей среды. Прогнозирование токсичности химических веществ на основе их физико-химической характеристики, в частности таких констант, как Тпл, Ткип, плотность или молекулярная масса, сопряжено со значительными неточностями, поскольку приведенные показатели не отражают особенностей взаимодействия вредных веществ и организма.
В 1977 г. представителями различных научных организаций нашей страны были всесторонне обсуждены понятия, принципы и критерии ускоренного гигиенического регламентирования факторов окружающей среды, что позволило согласовать унифицированное понятие «ориентировочный безопасный уровень воздействия» (ОБУВ) и юридический статус ПДК, разработанные ускоренными методами. Как указывают Г. Н. Красовский и соавторы (1982), ПДК вредных веществ в окружающей среде, выявленные ускоренными методами, имеют юридический статус ПДК, разработанных по традиционной схеме.
ОБУВ—государственный временный гигиенический норматив, ограничивающий содержание вредных веществ в объектах окружающей среды (атмосферном воздухе, воде водоемов, воздухе рабочей зоны и т. д.) с целью обеспечения безопасных условий труда и быта.
В результате совместной работы НИИОКГ им. А. Н. Сысина и НИИГТПЗ АМН СССР проанализированы материалы о гигиенических параметрах более 1000 веществ, рассчитаны около 5000 уравнений регрессии, из которых апробированы и рекомендованы для практического использования наиболее надежные. Теоретически обоснована возможность использования материалов по гигиеническому нормированию веществ в различных объектах окружающей среды не только для расчета токсико-гигиенических параметров, но и для прогноза опасности химических соединений. Установлено, что уравнения для ряда веществ, близких по физико-химическим свойствам и характеру биологического действия, обладают большей точностью, чем рассчитанные для общей совокупности. Хотя и при их использовании возможны ошибки и неточности. М. Iversen (1983) исследовал зависимость между величинами ЛД50 и ЛК50 147 различных ксенобиотиков и их пороговыми дозами. Все соединения автор разделил на 4 группы: 1) раздражающие вещества- 2) галоидсодержащие алифатические соединения- 3) ароматические соединения- 4) эфиры, спирты и кетоны. Внутри каждой группы установлена линейная зависимость между показателями острой токсичности и пороговыми дозами в системе двойных логарифмических координат. Относительно низкий коэффициент корреляции (0,61) и большие ошибки в определении ПД по показателям острой токсичности свидетельствуют об определенном риске.
С. М. Новиков (1984) проанализировал зависимость величины МНК от выраженности кумулятивных свойств на двух выборках вредных веществ (около 200 соединений). При этом выявлена очень слабая связь между изученными показателями, что не позволяет ввести в расчетные формулы коэффициент кумуляции. В связи с этим при гигиеническом нормировании вредных веществ целесообразно, как это предлагают Г. Н. Красовский и соавторы (1979), ориентироваться на среднее время гибели животных и пороги подострого действия. С. М. Новиков (1984) предложил уравнения для расчета МНК по величине порога подострого эффекта, установленного в 30—45-дневном эксперименте:
Анализ структуры веществ, для которых утверждены ПДК в трех средах (Ю. С. Каган и соавт., 1979), показал, что практически все они могут рассматриваться как аналоги нормированных веществ, т. е. веществ, принадлежащих к уже изученным токсикологическим классам химических соединений. Ю. С. Каган и другие ученые ставят вопрос о пересмотре общепринятых схем установления ПДК и отказе от длительных хронических экспериментов при обосновании гигиенических регламентов по общетоксическому эффекту, ограничившись изучением физико-химических свойств, установлением основных параметров острой токсичности, кумулятивных свойств, выявлением наиболее поражаемых органов и систем, а при необходимости — отдаленных и аллергенных эффектов. Указанной информации, по мнению авторов, достаточно для обоснования надежных показателей ПДК, подкрепленных соответствующими апробированными расчетными методами, тем более, как показывает опыт, отсутствуют существенные различия в величине нормативов, выявленных по развернутой программе или с помощью ускоренных методов. Однако в ряде случаев ускоренное нормирование невозможно в связи с необходимостью изучения канцерогенного или мутагенного действия химических веществ.
Н. В. Гринь и Н. Н. Говорунова (1983) предложили использовать при разработке ОБУВ материалы эмбриотоксикологического эксперимента. Авторы отмечают, что многие химические вещества с молекулярной массой не более 600 почти беспрепятственно проходят в плод через плаценту в количествах, превышающих физиологический уровень. В то же время эмбрион не способен реагировать на патогенные факторы реактивными процессами и различные ксенобиотики вызывают в нем однотипные неспецифические сдвиги, начиная с нарушения обменных процессов и кончая гибелью его тканевых элементов. Учитывая относительную простоту исследований и сравнительно небольшой срок эксперимента, авторы рекомендуют определять эмбриотоксический эффект при обосновании ОБУВ металлосодержащих соединений. Однако, по мнению С. С. Brown (1983), разработка и использование новых статистических методов и моделей для экстраполяции не имеет смысла без получения более точных данных о механизмах действия химических веществ. Фармакокинетический механизм поведения веществ может существенно влиять на возможности и принципы экстраполяции от высоких доз к малым, особенно для веществ, характеризующихся нелинейной кинетикой.
Важное место в проблеме ускоренного нормирования занимает разработка методов экспресс-экспериментального установления ПДК химических веществ по результатам острых опытов и краткосрочных экспериментов. С проблемой ускоренного нормирования тесно связано предложение о едином нормировании химических веществ в различных объектах окружающей среды. Что касается гигиенической регламентации выделения вредных веществ из полимерных материалов, то в целях повышения надежности ДУ и ДКМ, безусловно, требуется их унификация. Под унификацией в данном случае следует понимать соблюдение принципа, согласно которому родственные гигиенические нормативы должны рассчитываться от одного важнейшего количественного признака химического вещества— максимально безвредной дозы (МБД), установленной в хроническом эксперименте. Если провести аналогию с физикой или химией, то МБД в хроническом опыте — такая же определенная характеристика вещества, как его плотность или температура плавления. Поэтому поскольку при выведении других производных характеристик вещества в формулу закладывают однажды установленную величину этих показателей, то и при вычислении родственных гигиенических нормативов следует использовать МБД и коэффициенты, учитывающие условия поступления веществ в организм и необходимый запас. Так как все гигиенические нормативы определяются с учетом фактов, известных в настоящий момент, но никак не в будущем, можно игнорировать то обстоятельство, что величина МБД зависит от чувствительности методов ее выявления.
Следовательно, в настоящее время актуальной задачей санитарной токсикологии является разработка единой схемы хронического опыта, который позволяет установить МБД при ингаляционном и пероральном поступлении вещества с последующим расчетом ПДК в воде водоемов, атмосферном воздухе, воздухе рабочей зоны, допустимых количеств ксенобиотиков в пищевых продуктах, ДУ и ДКМ. Экспериментальные работы, завершающиеся обоснованием только 1 из 7 нормативов, сопряжены с потерей важной информации (В. О. Шефтель, 1981). К сожалению, реализация такого принципа не может быть обеспечена существующими методами пересчета. Поэтому для установления максимально допустимой нагрузки необходимо иметь представление о максимально безвредных дозах при поступлении вещества с воздухом, водой, пищей, а также через кожу.
