Регламентация химических канцерогенов - токсикология полимерных материалов

Пока еще не разработана унифицированная методология для регламентации химических канцерогенов в окружающей среде на основе экспериментов с животными. Это связано с отсутствием единой гипотезы канцерогенеза и неизученностью его механизмов. В. С. Турусов и Ю. Д. Парфенов (1986) отмечают, что до настоящего времени многие вопросы, связанные с изучением химического канцерогенеза, остаются спорными (продолжительность введения вещества, выбор и число доз, методы статистического анализа и др.).
Токсичность вещества не может служить признаком наличия или отсутствия канцерогенности. Если полимерный материал имеет сложный состав, то он изучается в целом. При обнаружении канцерогенной активности исследуются отдельные компоненты ПМ.
Хотя корреляция между токсичностью и канцерогенностью отсутствует, данные о токсичности изучаемого препарата необходимо учитывать при планировании и организации эксперимента по выявлению бластомогенного действия, чтобы избежать преждевременной гибели животных из-за непредвиденных эффектов действия. При выборе биологических моделей предпочтение отдают грызунам (мыши, крысы, хомячки), учитывая их высокую чувствительность к индуцированию опухолей, относительно короткую продолжительность жизни, дешевое их содержание, доступность получения инбредных линий, наличие большого количества информации о    их физиологии и патологии.
Канцерогенность веществ в настоящее время изучается по схеме: два вида — два пола — два пути введения — одна доза (максимально переносимая). Тестирование и нормирование канцерогенов разделяется во времени. Нормирование их должно проводиться на животных одного пола и вида. Количественное регламентирование осуществляется по пороговому или беспороговому принципу.
Канцерогенную активность химических веществ рекомендуется оценивать на двух видах животных, несмотря на то, что положительный результат, полученный на одном виде животных, уже свидетельствует об опасности вещества. В то же время об отсутствии канцерогенного действия можно с достаточной достоверностью утверждать в том случае, когда отрицательные результаты получены на 2 видах животных.
Хотя из трех указанных видов грызунов чаще всего используют мышей и крыс, хомячки (сирийский, золотистый или европейский) являются адекватным объектом при изучении канцерогенного действия химических веществ на дыхательную систему и мочевой пузырь. Клетки хомячков используют для изучения процессов трансформации in vitro и, поскольку в большинстве случаев эти исследования требуют обратной трансплантации клеток в организм сингенного хозяина, их применение в последнее время расширяется. В последние годы стало возможным получение чистых линий этих животных.
Канцерогенные свойства веществ изучаются преимущественно на животных чистых линий. Преимуществами инбредных животных являются: известная средняя продолжительность жизни, частота спонтанных новообразований, наличие одного или двух особо чувствительных органов. Возникновение опухолей в них отчасти может расцениваться как интенсификация процессов, ведущих к развитию спонтанных опухолей в этом органе. При этом предпочтение отдают низкораковым (с низкой частотой развития опухолей) линиям. В то же время нелинейные животные более устойчивы к интеркуррентным заболеваниям и больше используются в опытах для выявления канцерогенного действия веществ на неподозреваемый орган — мишень.

У нелинейных животных трудно установить частоту развития опухолей в контрольной группе, а также провести сравнение экспериментальных данных, полученных в различное время или в разных лабораториях.
Выбор вида животных зависит также от их специфической чувствительности. Опухоли печени легче индуцировать у мышей, чем у крыс, а подкожные опухоли чаще возникают у крыс, чем у мышей. Хомячки более чувствительны к бластомогенному воздействию на мочевой пузырь, чем мыши и крысы.
В эксперименте рекомендуется использовать 2 вида животных (самцы и самки каждого вида). Предпочтительно вести эксперимент на 8—12-недельных мышах или крысах, линейных или беспородных. В каждой подопытной группе должно быть не менее 50 самцов и 50 самок. Таким образом, для испытания одного вещества по указанной схеме необходимо не менее 600 животных (300 мышей и 300 крыс).  Так, при одновременном изучении 4 веществ необходимо 100 контрольных животных.
В контрольной группе должно быть больше животных, чем в подопытной группе. Кроме «отрицательного» контроля (интактные животные), в последние годы все чаще применяют «положительный» контроль (животные получают известный канцероген в дозе, которая согласно имеющимся данным вызывает канцерогенный эффект). Срок воздействия вещества для мышей обычно равен 18—20 мес, для крыс — 24 мес. При в/ж и н/к нанесении, учитывая активное механическое вмешательство экспериментатора, возможно введение веществ 2—4 раза в неделю. Затем животных оставляют в эксперименте до их естественной гибели (мышей до 2 лет, крыс до 3). Животных, переживших это время, умерщвляют.
В ряде случаев затравку животных целесообразно производить в пренатальном периоде или сразу после их рождения. С целью сокращения сроков исследования канцерогенности без нарушения надежности результатов некоторые авторы используют метод Ларсена (1947) — трансплацентарное введение вещества в позднем антенатальном периоде с учетом повышенной чувствительности плода к различным воздействиям. По мнению О. П. Чепиноги (1967), этот метод не имеет преимуществ по сравнению с другим.
В последнее время проводятся исследования по изысканию методов прогнозирования канцерогенной опасности веществ по биохимическим показателям, изменение которых сопутствует развитию опухолей, особенно в предопухолевом периоде.
В экспериментах по изучению канцерогенной активности химических веществ рекомендуется использовать 2 пути введения, один из которых соответствует реальному. При исследовании компонентов полимерных материалов, применяемых в строительстве, пищевой промышленности, для изготовления одежды и обуви, один путь введения соответственно должен быть ингаляционным, пероральным или накожным. При выборе доз исходят из предпосылки о том, что наиболее выраженный канцерогенный эффект проявляется при введении максимально переносимой дозы. Однако использование максимально переносимых доз ведет к «завышению» предполагаемой канцерогенной опасности химических веществ (В. М. Воронин, 1985).
При испытании нескольких доз для определения дозовой зависимости должно быть обеспечено выживание в течение длительного срока большинства животных.
Пероральный путь введения является адекватным при изучении полимерных материалов и их компонентов, используемых в водоснабжении или при контакте с пищевыми продуктами. Вещества, их растворы в воде или масле, а также водные вытяжки из пластмасс вводят в корм, питьевую воду или через желудочный зонд. Вещества, дающие стабильные растворы или эмульсии, могут быть даны через поилки.
Смазывание кожи применяется при изучении веществ, входящих в состав полимерных материалов, используемых для изготовления одежды и обуви. При этом чаще применяют мышей гибридов первого поколения (C57BLXСВА) F, а также C57BL,CBA. Возможно использование и беспородных животных, а также кроликов. На крысах такие опыты проводить не следует вследствие относительной резистентности их кожи к индукции опухолей.
В качестве растворителя рекомендуется ацетон, хотя предпочтительнее наносить вещество или прикладывать ПМ к коже в нативном виде. Иногда используют растительные масла или слабый раствор спирта. Волосы на месте нанесения вещества выстригают.
Внутритрахеальное введение используют в случае, когда ингаляция является основным путем попадания вещества в организм человека (например, летучие компоненты строительных пластмасс). В эксперимент берут крыс, хомяков и мышей. У крыс и хомяков легко возникают спонтанные опухоли, но эти животные склонны к легочным заболеваниям, что затрудняет проведение эксперимента. У мышей некоторых линий нередко возникают спонтанные аденомы легких.
Инстилляцию веществ в легкие можно проводить в виде водных растворов и суспензий, а также коллоидных белковых растворов. Для увеличения срока пребывания вещества в легких рекомендуется добавление к раствору или суспензии порошка туши или инертных пылей. Во всех случаях необходим соответствующий контроль. Вещество вводят под легким эфирным наркозом 1 раз в 15 или 30 дней (0,2—0,5 мл крысам, 0,2 мл хомякам, 0,05—0,1 мл мышам).
Ингаляционная затравка является адекватной для изучения летучих компонентов полимерных материалов. Кроме этого, практикуется подкожное
введение, позволяющее исследовать как местный, так и системный эффект. Имплантация кусочков полимерных материалов подопытным животным применяется редко.
При оценке результатов учитывают:

1. Количество животных с опухолями всех локализаций и по каждой локализации в отдельности.
2. Характер опухолей (доброкачественные, злокачественные).
3. Среднее количество опухолей на 1 животное.
4. Время появления или обнаружения опухолей (латентный период).
5. Продолжительность жизни животных каждой подопытной группы (сокращение длительности жизни может «снизить» число выявленных опухолей).
6. Локализация опухолей, их гистологическое строение. При атом необходимо учитывать, что возникновение опухолей в органах и тканях, где они встречаются редко, является более важным показателем канцерогенности, чем повышение частоты новообразований, типичных для данного вида животных. Исследуемое вещество признается канцерогеном, если хоть в одной из опытных групп имеется статистически значимое превышение частоты возникновения опухолей по сравнению с контролем. К слабым канцерогенам могут относиться вещества, при введении которых у животных отмечается учащение возникновения спонтанных опухолей или существенное укорочение их латентного периода по сравнению с контролем.

Заключение о канцерогенности соединения выдает Комитет по канцерогенным веществам МЗ СССР после изучения представленных ему материалов.
Предложенные классификации канцерогенов (Л. М. Шабад, 1968, и др.) носят качественный характер. Для гигиенической регламентации необходимо выявление количественных зависимостей и определение порога канцерогенного действия (И. В. Саноцкий и соавт., 1978).
В СССР (1972—1979) впервые в мире на основе концепции пороговости бластомогенного эффекта разработаны ПДК для одного из наиболее распространенных и опасных канцерогенов — бенз(а)пирена в атмосферном воздухе, воздухе производственных помещений, воде водоемов и почве.
В методологии нормирования канцерогенов вопрос о пороговости является основным. Дискуссия по этому вопросу продолжается, в связи с чем необходимо кратко остановиться на основных ее положениях. В пользу беспороговости канцерогенного эффекта свидетельствуют следующие факты: 1) саморепликационная природа раковых клеток, 2) суммация необратимых эффектов канцерогенеза, 3) возможность возникновения рака после воздействия единственной дозы через длительное время после исчезновения ее из организма, 4) возможность развития рака в результате мутации соматических клеток.
В. А. Книжников и соавторы (1977) считают, что установить порог канцерогенного действия в эксперименте практически невозможно в связи с ограниченным числом животных в группах. Стохастический характер канцерогенного эффекта предопределяет, что возможность его определения обусловлена как дозой, так и численностью популяции, подвергающейся влиянию данной дозы вещества. Поэтому «максимально недействующая» в эксперименте доза канцерогена относится только к взятой в опыт численности животных, а определенный таким образом порог является мнимым. На графике доза — ответ кажется, что эта зависимость линейна для всего спектра доз канцерогена и что один порог существует для всей популяции. Однако многофакторная теория канцерогенеза определяет нелинейный характер зависимости и на графике находит порог не истинный, а усредненный. Для популяции, ужа подвергшейся воздействию канцерогенов, некоторый дополнительный канцероген будет повышать ожидаемый уровень опухолей, независимо от низкого уровня воздействия. В. А. Книжников (1985) отстаивает подход, согласно которому воздействие сколь угодно малой дозы канцерогена рассматривается как дополнительное R существующему фоновому воздействию бластомогенных факторов окружающей среды и сопряженное с дополнительным, отличным от нуля, риском возникновения опухоли. Требование устанавливать гигиенические регламенты для канцерогенных факторов на уровне абсолютной безопасности является нереальным.
Экспериментальные данные, как считает И. В. Филюшкин, не могут доказать ни существование порога канцерогенного действия, ни отсутствие его. Утверждение о существовании этого порога основано не на экспериментальных данных, а на аналогии с общетоксическими эффектами, где порог устанавливается экспериментально. D. G. Hoel (1975), С. С. Brown, (1976) считают, что нет достаточных оснований признавать существование порога генотоксических химических канцерогенов, поскольку для развития опухоли достаточно одной молекулы канцерогена, вступившей во взаимодействие с ДНК. Для канцерогенов, действующих по негенетическому механизму, в принципе может быть установлен порог (твердые материалы, гормоны, иммунодепрессанты и др.).
Б. А. Курляндский и Н. Н. Невзорова (1985) отмечают, что пороговая гипотеза наиболее вероятна в тех случаях, когда возникновение опухоли не связано с генотоксическим эффектом, а обусловлено такими, например механизмами, как токсический дисгомеостаз. В случае специфической канцерогенной активности вопрос остается открытым.
Проблема порога имеет не столько теоретическое, сколько практическое значение (И. В. Филюшкин, 1983). Дополнительные материалы по вопросу существования порога канцерогенного действия можно найти на страницах журнала «Вопросы онкологии» за 1982—1984 гг.
По мнению известного немецкого онколога X. Друкрея (1961), исключительно малые дозы канцерогена не вызывают рак не потому, что существует пороговая доза, а потому, что в этом случае время, необходимое для индукции рака, превышает продолжительность жизни животных. Автор предложил вычислять дозу, которая может вызвать рак за пределами жизни человека. В. А. Книжников (1979) считает, что слабая сторона этой теории заключается в недооценке вероятностного характера канцерогенного эффекта, из чего следует, что за пределы продолжительности жизни при снижении дозы можно вывести средний латентный период появления опухолей или латентный период возникновения опухолей в данной группе животных. Но по мере увеличения численности групп повышается вероятность появление животных, у которых опухоль успеет возникнуть.
Не менее убедительными факторами располагают сторонники теории существования порога канцерогенного эффекта, в первую очередь обращающие внимание на то, что не все молекулы канцерогена способны в равной степени абсорбироваться в организме и не все попавшие в организм молекулы реагируют с тканью-мишенью. В результате метаболизма возможно образование неканцерогенных производных.

1. Я. Янышева, И. А. Черниченко и Н. В. Баленко (1981) приводят следующие доводы в пользу концепции пороговости эффекта при воздействии канцерогенов на организм.
2. Наличие зависимости доза — время — эффект для всех групп химических канцерогенных соединений, изученных в области экспериментальной онкологии и профессиональной патологии.
3. Способность организма противостоять возникновению опухолевого роста, благодаря наличию системы приспособительных и компенсаторно-защитных реакций, обеспечивающих обезвреживание канцерогенного фактора, нормализацию нарушенных процессов и восстановление поврежденных структур и функций (Л. М. Шабад, 1975- Р. Е. Кавецкий и соавт., 1970).
4. Указание на то, что мышьяк, селен, некоторые гормоны и др., в небольших дозах необходимые для нормальной жизнедеятельности организма, при достижении определенного количественного уровня или снижении резистентности организма проявляют свою канцерогенную активность.

Н.        Я. Янышева и соавторы (1981) установили критические дозы бенз(а)пирена, после получения которых дальнейшее введение вещества не отражается на частоте новообразований и времени их появления. К моменту появления первой опухоли в органах-мишенях обнаруживаются близкие концентрации канцерогена, независимо от величины введенной дозы. Этот факт указывает на необходимость достижения определенной концентрации канцерогена для реализации первичного опухолевого эффекта. Отмечено, что время образования первой и последующей опухолей зависит от скорости его накопления.
Ряд зарубежных ученых считает, что вопрос о том, существует ли действительный порог, менее важен, чем практический порог, когда определяется степень опасности для человека (N. Mantel, 1963- D. Roll, 1978). В. А. Книжников и Н. Н. Литвинов (1980) рекомендуют устанавливать ПДК канцерогенов в окружающей среде на уровне, когда теоретическая величина возможного учащения смертельных случаев от рака нереальна или не превышает значений, обнаруживаемых современными методами эпидемиологических исследований.

1. Я. Янышева и соавторы (1981) рассматривают время развития опухолей как лимитирующий показатель при оценке канцерогенной активности веществ. Они разработали математические модели, позволяющие прогнозировать вероятностный риск возникновения опухолей на заданный отрезок времени. Использованная авторами математическая модель позволила рассчитать теоретический риск возникновения опухолей от действия малых доз канцерогена, оказавшихся неэффективными в эксперименте. При нормировании канцерогенов должны учитываться следующие положения (Н. Я. Янышева и соавт., 1982).
2. Испытание различных доз канцерогена в пожизненном эксперименте на животных для определения минимально эффективной, максимально неэффективной и оптимальной доз.
3. Математическое моделирование зависимостей доза — эффект и доза — время проявления эффекта.
4. Прогнозирование вероятностного риска возникновения опухолей от воздействия малых доз канцерогена и оценка его опасности на основе зависимости доза — время.
5. Экстраполяция дозы канцерогена с животных на человека.
6. Эпидемиологические наблюдения.

Канцерогенный эффект независимо от условий опыта подчиняется зависимостям доза — эффект и доза — время. Эффект кратности проявляется в усилении канцерогенеза при фракционировании больших доз вещества и ослаблении в области малых величин, вплоть до «нулевого результата» (Н. Я. Янышева и соавт., 1985). Выраженность канцерогенного эффекта зависит от суммарной поглощенной дозы, а время его проявления — от разовой (суточной) величины.
Если полная схема исследований по нормированию канцерогенов рассчитана на 3 и более года, то моделирование зависимости доза — время позволяет перейти к ускоренной регламентации.
При этом большое значение имеет научно-обоснованный выбор коэффициента запаса с учетом опасности канцерогена, показателем которой может служить прогнозируемое среднее время развития опухолей при изменении дозы вещества (Н. Я. Янышева, И. А. Черниченко, Н. В. Баленко, 1981). Математическим выражением последнего является тангенс угла наклона кривой доза — среднее время развития опухолей. Вопрос о гигиенической регламентации канцерогенов еще окончательно не решен. Некоторые авторы считают необходимым ориентироваться на природный фон как ПДК для канцерогенов, встречающихся в нормальных тканях животных и растений. Близкую к этой позиции занимают Б. А. Курляндский и соавторы (1968), предложившие определять минимально действующую дозу канцерогена в точке пересечения кривой доза — эффект и нижней границы колебаний уровня спонтанного фона канцерогенности в данной популяции.