Изучение мутагенной активности - токсикология полимерных материалов

Изучение мутагенной активности компонентов полимерных материалов. Генетические исследования, проводимые в интересах гигиенической регламентации содержания химических веществ в окружающей среде, решают следующие основные задачи: выявление химических мутагенов- оценка степени их опасности для населения- разработка гигиенических рекомендаций по безопасному применению химических веществ, обладающих мутагенными свойствами.
«Временные методические рекомендации по оценке потенциальной мутагенной опасности пестицидов» (1980 г.) в качестве объекта при изучении мутагенной активности химических веществ предлагают использовать млекопитающих (метод цитогенетического анализа клеток костного мозга и метод доминантных летальных мутаций) и культуру лейкоцитов человека (метод хромосомного анализа).

Рис. 4. Наиболее часто применяемые методы изучения мутагенной активности химических веществ
Для определения способности вещества индуцировать генные (точковые) мутации рекомендуется применять микробные тесты с метаболической активацией веществ (рис. 4).
В. С. Журков (1981) считает, что при проведении генетических исследований на млекопитающих длительность опытов должна . быть достаточной для прогнозирования хронического мутагенного действия. Для прогноза величины цитогенетического эффекта химических веществ в клетках костного мозга млекопитающих при хроническом воздействии можно ограничиться подострым экспериментом. Автор предлагает 10-суточную пероральную или ингаляционную затравку. Для анализа мутагенной активности химических веществ в опытах по индукции доминантных деталей у самцов млекопитающих длительность эксперимента должна соответствовать продолжительности постмейотических и мейотических стадий сперматогенеза, т. е. 5 нед для мышей и 7 нед для крыс. Поскольку прямые методы, позволяющие установить способность химического вещества вызывать наследуемые мутации у человека, в настоящее время отсутствуют, информация о возможности возникновения мутаций в половых клетках человека может быть получена несколькими путями.

1. Установлением факта повреждения ДНК, включающего ее изменения, стимулирование репарации ДНК, тесты на выявление генных мутаций, в том числе и на микроорганизмах.
2. Обнаружением точковых или генных мутаций на целом организме, в том числе и на насекомых.
3. Определением хромосомных мутаций, включая цитогенетические тесты на млекопитающих, метод доминантных леталей на млекопитающих и тест наследуемой транслокации на грызунах.

Приведем краткую характеристику основных методов изучения генетической активности химических веществ.
Тест Эймса (1973) «Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella» (методическое указание- М., 1977 г.) позволяет оценить мутагенность по количеству ревертантов среди клеток специального штамма сальмонелл при инкубации их с веществом в присутствии тканевых гомогенатов грызунов или человека, выполняющих функцию активатора. По- видимому, мутации у бактерий могут быть чувствительным показателем для проверки повреждения ДНК, хотя использование этих результатов в целях гигиенической регламентации затруднено из-за различий в концентрации и распределении химических веществ и отличий в физиологии и метаболизме.
Исследования на насекомых. Наибольшей популярностью пользуется Dr. melanogaster, генетически хорошо изученное насекомое. С помощью дрозофилы может оцениваться частота мутаций на различных стадиях развития половых клеток. Одним из наиболее чувствительных является тест сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций, так как Х-хромосома представляет почти 15 генома. В отличие от микроорганизмов, у насекомых достаточно развита система ферментов, которая, очевидно, метаболизирует чужеродные соединения теми же путями, что и у млекопитающих.
Определение цитогенетической активности на клетках костного мозга мышей. Высокая степень клеточной пролиферации в костном мозге не позволяет оценить истинную цитогенетическую активность веществ при длительном воздействии. Поэтому исследование проводят после однократного или пятикратного (в течение 5 дней) внутрижелудочного введения вещества беспородным белым мышам. Изучение мутагенной активности начинают с больших доз (12—15 от ЛД50), которые затем снижают. Костный мозг фиксируют в конце митотического цикла (через 20—24 ч после воздействия). Каждую дозу проверяют не менее, чем на 6 животных. От каждой мыши исследуют не менее 100 метафаз.
Определение цитогенетической активности в культуре лимфоцитов периферической крови человека. Для оценки действия химических веществ на хромосомы обычно используют коротко живущую in vitro культуру лимфоцитов человека, куда добавляют вещество в виде раствора или суспензии в питательной среде 199. В случае обнаружения мутагенного эффекта дозу (концентрацию) снижают. Структурная перестройка хромосом, происходящая вследствие неправильной репарации хромосомных разрывов, может привести к делециям, дупликациям и транслокациям. Наблюдается также аберрация числа хромосом вследствие их нерасхождения.
Тесты доминатных леталей и другие системы in vivo. Метод основан на предположении, что в яйцеклетках или сперме происходит одиночная мутация, летальная для эмбриона и гетерозиготная в поражаемом локусе. Недостатком метода является то, что большое количество мутагенов дает отрицательный ответ в этом месте. Кроме этого, химические вещества, прерывающие сперматогенез, могут дать ошибочные положительные результаты.
Тест специфических локусов на мышах. Метод состоит в спаривании беспородных мышей, самок или самцов, подвергавшихся воздействию вещества, с линией, гомозиготной по ряду известных рецессивных генов. Рецессивные гены фенотипически проявляются в гомозиготном состоянии. В случае возникновения мутации в любом из изучаемых локусов половых клеток, подвергшихся воздействию животных, она будет обнаружена в потомстве (Russel, 1951- Cattanach, 1971).
По мнению большинства исследователей, оптимальными методами оценки мутагенности химических веществ в опытах на млекопитающих являются анализ хромосомных аберраций в клетках костного мозга и учет доминантных леталей в половых клетках самцов.
Оценка мутагенной активности химического вещества определяется тремя показателями.

1. Установлением пороговой дозы мутагена согласно традиции отечественной школы гигиенического нормирования. При этом определяется избирательность мутагенного действия. При установлении норматива используется коэффициент запаса (И. В. Саноцкий, В. Н. Фоменко, 1979- Г. Н. Красовский и соавт., 1979- М. А. Пилинская, А. И. Куриный, 1980). Методический уровень современных генетических исследований позволяет достоверно определить пороговую дозу, повышающую частоту мутаций в 2—3 раза по сравнению с контролем, что не гарантирует от появления мутантных клеток при меньших уровнях воздействия в достаточно больших популяциях.
2. Выраженностью мутагенного действия, что основывается на сравнении с показателем спонтанного уровня мутаций и оценке мутагенной опасности по степени превышения этого уровня (Н. П. Бочков, 1975). Принимается, что максимальное превышение спонтанного уровня мутаций от действия всей суммы химических мутагенов не должно превышать 10 %, а от изолированного действия отдельных мутагенов по разным оценкам —0,1 —1          %. Этот подход требует установления зависимости эффекта от дозы, что не всегда возможно.
3. Универсальностью действия, т. е. проявление мутагенного эффекта на различных объектах (хромосомные и генные мутации).

Вещества, вызывающие цитогенетический эффект только в высоких дозах, рассматриваются как сомнительные мутагены. В зависимости от степени мутагенной опасности вещества запрещают или регламентируют их использование.

Таблица 19. Этапная схема оценки мутагенной активности химических факторов окружающей среды при их гигиенической регламентации

Таким образом, согласно современным представлениям, гигиеническая оценка мутагенного действия факторов окружающей среды (в том числе ПМ и их компонентов) должна базироваться на этапности проведения исследований, использования для регламентации только данных опытов на млекопитающих, анализе зависимости мутагенного эффекта от дозы. В. С. Журков и В. В. Соколовский (1985) предложили этапную схему оценки мутагенной активности факторов среды (табл. 19).
На первом этапе анализируются литературные данные. При отсутствии, или противоречивых, или сомнительных результатах ставятся эксперименты с использованием быстрых, недорогих и информативных тестов (тест Эймса, анализ частоты полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге в острых опытах на млекопитающих — микроядерный тест, учет хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов человека in vitro).
Вещества, с помощью которых обнаружен мутагенный эффект, исследуются на втором этапе, где производят метафазный учет хромосомных аберраций и анализ доминантных летальных мутаций у самцов мышей или крыс. При этом длительность эксперимента для учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга составляет 10—15 сут, для анализа доминантных летальных мутаций у самцов мышей — 5 нед, у самцов крыс — 7 нед. В опытах изучают 4—5 доз, начиная с 110 от ЛД50. В качестве минимально действующей дозы мутагена (МДД) принимается минимальная доза вещества, вызывающая достоверное повышение уровня мутаций в опытной группе по сравнению с контрольной.
Допустимую дозу мутагена (ДДмут) устанавливают с. учетом доли превышения мутагенного эффекта над спонтанным уровнем
(В. С. Журков, 1981). Поскольку максимальное превышение спонтанного уровня от действия одного мутагена не должно превышать 1 %, а применяемые на 2-м этапе методы и схемы экспериментов позволяют достоверно выявлять повышение спонтанного уровня на 100—200 %, то ДДмут рассчитывают по формуле:

Допустимое превышение фона на 1 % получено также в экспериментах Н. П. Бочкова и соавторов (1975) и Committee 17 Enviromental mutagens hazards (1975). При отсутствии экспериментально установленной зависимости доза — мутагенный эффект следует вычислять ДДмут на основе линейной экстраполяции от МДД. Математической основой применения линейной модели для расчета дозы, вызывающей повышение уровня мутаций на 1 % по сравнению с контролем, является тот факт, что до этого уровня выбор формы математической модели дает небольшие различия (D. W. Gaylor, 1983).
Используется также следующая схема тестирования на мутагенность: тест на обратные мутации у S. typhimurium, мутационный анализ у Е. Coli, цитогенетический анализ на клетках костного мозга млекопитающих in vivo и микроядерный тест.
В. В. Соколовский и В. С. Журков (1982) считают необходимым разработку и введение нового интегрального показателя — суммарной мутагенной активности факторов окружающей среды для оценки реальной нагрузки в условиях современного мира. Этим же целям служит разработка генетико-гигиенических классификаций опасности мутагенов в окружающей среде.
Сегодня нет прямой корреляции между данными лабораторных тестов и результатами исследований мутагенеза на человеке. Однако имеющаяся информация доказывает необходимость принятия их во внимание при разработке мер безопасности при внедрении новых полимерных материалов в народное хозяйство и быт. Использующиеся методы еще настолько малочувствительны, что многие химические мутагены могут быть не замечены. Поэтому изучение мутагенной активности компонентов полимерных материалов должно стать обязательной частью их гигиенической оценки.