Изучение мутагенной активности - токсикология полимерных материалов
Изучение мутагенной активности компонентов полимерных материалов. Генетические исследования, проводимые в интересах гигиенической регламентации содержания химических веществ в окружающей среде, решают следующие основные задачи: выявление химических мутагенов- оценка степени их опасности для населения- разработка гигиенических рекомендаций по безопасному применению химических веществ, обладающих мутагенными свойствами.
«Временные методические рекомендации по оценке потенциальной мутагенной опасности пестицидов» (1980 г.) в качестве объекта при изучении мутагенной активности химических веществ предлагают использовать млекопитающих (метод цитогенетического анализа клеток костного мозга и метод доминантных летальных мутаций) и культуру лейкоцитов человека (метод хромосомного анализа). 
Рис. 4. Наиболее часто применяемые методы изучения мутагенной активности химических веществ
Для определения способности вещества индуцировать генные (точковые) мутации рекомендуется применять микробные тесты с метаболической активацией веществ (рис. 4).
В. С. Журков (1981) считает, что при проведении генетических исследований на млекопитающих длительность опытов должна . быть достаточной для прогнозирования хронического мутагенного действия. Для прогноза величины цитогенетического эффекта химических веществ в клетках костного мозга млекопитающих при хроническом воздействии можно ограничиться подострым экспериментом. Автор предлагает 10-суточную пероральную или ингаляционную затравку. Для анализа мутагенной активности химических веществ в опытах по индукции доминантных деталей у самцов млекопитающих длительность эксперимента должна соответствовать продолжительности постмейотических и мейотических стадий сперматогенеза, т. е. 5 нед для мышей и 7 нед для крыс. Поскольку прямые методы, позволяющие установить способность химического вещества вызывать наследуемые мутации у человека, в настоящее время отсутствуют, информация о возможности возникновения мутаций в половых клетках человека может быть получена несколькими путями.
- Установлением факта повреждения ДНК, включающего ее изменения, стимулирование репарации ДНК, тесты на выявление генных мутаций, в том числе и на микроорганизмах.
- Обнаружением точковых или генных мутаций на целом организме, в том числе и на насекомых.
- Определением хромосомных мутаций, включая цитогенетические тесты на млекопитающих, метод доминантных леталей на млекопитающих и тест наследуемой транслокации на грызунах.
Приведем краткую характеристику основных методов изучения генетической активности химических веществ.
Тест Эймса (1973) «Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella» (методическое указание- М., 1977 г.) позволяет оценить мутагенность по количеству ревертантов среди клеток специального штамма сальмонелл при инкубации их с веществом в присутствии тканевых гомогенатов грызунов или человека, выполняющих функцию активатора. По- видимому, мутации у бактерий могут быть чувствительным показателем для проверки повреждения ДНК, хотя использование этих результатов в целях гигиенической регламентации затруднено из-за различий в концентрации и распределении химических веществ и отличий в физиологии и метаболизме.
Исследования на насекомых. Наибольшей популярностью пользуется Dr. melanogaster, генетически хорошо изученное насекомое. С помощью дрозофилы может оцениваться частота мутаций на различных стадиях развития половых клеток. Одним из наиболее чувствительных является тест сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций, так как Х-хромосома представляет почти 15 генома. В отличие от микроорганизмов, у насекомых достаточно развита система ферментов, которая, очевидно, метаболизирует чужеродные соединения теми же путями, что и у млекопитающих.
Определение цитогенетической активности на клетках костного мозга мышей. Высокая степень клеточной пролиферации в костном мозге не позволяет оценить истинную цитогенетическую активность веществ при длительном воздействии. Поэтому исследование проводят после однократного или пятикратного (в течение 5 дней) внутрижелудочного введения вещества беспородным белым мышам. Изучение мутагенной активности начинают с больших доз (12—15 от ЛД50), которые затем снижают. Костный мозг фиксируют в конце митотического цикла (через 20—24 ч после воздействия). Каждую дозу проверяют не менее, чем на 6 животных. От каждой мыши исследуют не менее 100 метафаз.
Определение цитогенетической активности в культуре лимфоцитов периферической крови человека. Для оценки действия химических веществ на хромосомы обычно используют коротко живущую in vitro культуру лимфоцитов человека, куда добавляют вещество в виде раствора или суспензии в питательной среде 199. В случае обнаружения мутагенного эффекта дозу (концентрацию) снижают. Структурная перестройка хромосом, происходящая вследствие неправильной репарации хромосомных разрывов, может привести к делециям, дупликациям и транслокациям. Наблюдается также аберрация числа хромосом вследствие их нерасхождения.
Тесты доминатных леталей и другие системы in vivo. Метод основан на предположении, что в яйцеклетках или сперме происходит одиночная мутация, летальная для эмбриона и гетерозиготная в поражаемом локусе. Недостатком метода является то, что большое количество мутагенов дает отрицательный ответ в этом месте. Кроме этого, химические вещества, прерывающие сперматогенез, могут дать ошибочные положительные результаты.
Тест специфических локусов на мышах. Метод состоит в спаривании беспородных мышей, самок или самцов, подвергавшихся воздействию вещества, с линией, гомозиготной по ряду известных рецессивных генов. Рецессивные гены фенотипически проявляются в гомозиготном состоянии. В случае возникновения мутации в любом из изучаемых локусов половых клеток, подвергшихся воздействию животных, она будет обнаружена в потомстве (Russel, 1951- Cattanach, 1971).
По мнению большинства исследователей, оптимальными методами оценки мутагенности химических веществ в опытах на млекопитающих являются анализ хромосомных аберраций в клетках костного мозга и учет доминантных леталей в половых клетках самцов.
Оценка мутагенной активности химического вещества определяется тремя показателями.
- Установлением пороговой дозы мутагена согласно традиции отечественной школы гигиенического нормирования. При этом определяется избирательность мутагенного действия. При установлении норматива используется коэффициент запаса (И. В. Саноцкий, В. Н. Фоменко, 1979- Г. Н. Красовский и соавт., 1979- М. А. Пилинская, А. И. Куриный, 1980). Методический уровень современных генетических исследований позволяет достоверно определить пороговую дозу, повышающую частоту мутаций в 2—3 раза по сравнению с контролем, что не гарантирует от появления мутантных клеток при меньших уровнях воздействия в достаточно больших популяциях.
- Выраженностью мутагенного действия, что основывается на сравнении с показателем спонтанного уровня мутаций и оценке мутагенной опасности по степени превышения этого уровня (Н. П. Бочков, 1975). Принимается, что максимальное превышение спонтанного уровня мутаций от действия всей суммы химических мутагенов не должно превышать 10 %, а от изолированного действия отдельных мутагенов по разным оценкам —0,1 —1 %. Этот подход требует установления зависимости эффекта от дозы, что не всегда возможно.
- Универсальностью действия, т. е. проявление мутагенного эффекта на различных объектах (хромосомные и генные мутации).
Вещества, вызывающие цитогенетический эффект только в высоких дозах, рассматриваются как сомнительные мутагены. В зависимости от степени мутагенной опасности вещества запрещают или регламентируют их использование.
Таблица 19. Этапная схема оценки мутагенной активности химических факторов окружающей среды при их гигиенической регламентации
Этап | Содержание исследования | Результат исследования |
1 | Выявление мутагенов | 1. Вещество-немутаген, регламентация без учета мутагенности |
2. Тест Эймса | 2. Вещество-мутаген, исследование на 2-м этапе | |
| ||
2 | Количественная оценка мутагенной активности в опытах на млекопитающих | Установление минимально действующей дозы и расчет допустимой дозы мутагена для обоснования |
1. Анализ хромосомных аберраций в клетках костного мозга | гигиенического норматива | |
2. Учет доминантных летальных мутаций у самцов |
Таким образом, согласно современным представлениям, гигиеническая оценка мутагенного действия факторов окружающей среды (в том числе ПМ и их компонентов) должна базироваться на этапности проведения исследований, использования для регламентации только данных опытов на млекопитающих, анализе зависимости мутагенного эффекта от дозы. В. С. Журков и В. В. Соколовский (1985) предложили этапную схему оценки мутагенной активности факторов среды (табл. 19).
На первом этапе анализируются литературные данные. При отсутствии, или противоречивых, или сомнительных результатах ставятся эксперименты с использованием быстрых, недорогих и информативных тестов (тест Эймса, анализ частоты полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге в острых опытах на млекопитающих — микроядерный тест, учет хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов человека in vitro).
Вещества, с помощью которых обнаружен мутагенный эффект, исследуются на втором этапе, где производят метафазный учет хромосомных аберраций и анализ доминантных летальных мутаций у самцов мышей или крыс. При этом длительность эксперимента для учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга составляет 10—15 сут, для анализа доминантных летальных мутаций у самцов мышей — 5 нед, у самцов крыс — 7 нед. В опытах изучают 4—5 доз, начиная с 110 от ЛД50. В качестве минимально действующей дозы мутагена (МДД) принимается минимальная доза вещества, вызывающая достоверное повышение уровня мутаций в опытной группе по сравнению с контрольной.
Допустимую дозу мутагена (ДДмут) устанавливают с. учетом доли превышения мутагенного эффекта над спонтанным уровнем
(В. С. Журков, 1981). Поскольку максимальное превышение спонтанного уровня от действия одного мутагена не должно превышать 1 %, а применяемые на 2-м этапе методы и схемы экспериментов позволяют достоверно выявлять повышение спонтанного уровня на 100—200 %, то ДДмут рассчитывают по формуле:
Допустимое превышение фона на 1 % получено также в экспериментах Н. П. Бочкова и соавторов (1975) и Committee 17 Enviromental mutagens hazards (1975). При отсутствии экспериментально установленной зависимости доза — мутагенный эффект следует вычислять ДДмут на основе линейной экстраполяции от МДД. Математической основой применения линейной модели для расчета дозы, вызывающей повышение уровня мутаций на 1 % по сравнению с контролем, является тот факт, что до этого уровня выбор формы математической модели дает небольшие различия (D. W. Gaylor, 1983).
Используется также следующая схема тестирования на мутагенность: тест на обратные мутации у S. typhimurium, мутационный анализ у Е. Coli, цитогенетический анализ на клетках костного мозга млекопитающих in vivo и микроядерный тест.
В. В. Соколовский и В. С. Журков (1982) считают необходимым разработку и введение нового интегрального показателя — суммарной мутагенной активности факторов окружающей среды для оценки реальной нагрузки в условиях современного мира. Этим же целям служит разработка генетико-гигиенических классификаций опасности мутагенов в окружающей среде.
Сегодня нет прямой корреляции между данными лабораторных тестов и результатами исследований мутагенеза на человеке. Однако имеющаяся информация доказывает необходимость принятия их во внимание при разработке мер безопасности при внедрении новых полимерных материалов в народное хозяйство и быт. Использующиеся методы еще настолько малочувствительны, что многие химические мутагены могут быть не замечены. Поэтому изучение мутагенной активности компонентов полимерных материалов должно стать обязательной частью их гигиенической оценки.
