Методические вопросы изучения комбинированного действия компонентов - токсикология полимерных материалов

Методические вопросы изучения комбинированного действия компонентов полимерных материалов. Понятие «комбинация веществ», как отмечают З. А. Волкова (1973), В. В. Кустов и соавторы (1975), И. М. Трахтенберг и соавторы (1975), является неоднозначным. На наш взгляд, можно выделить три основных типа комбинаций.

1. Стабильные комбинации — комбинации, в которых известны все компоненты и строго заданы их соотношения. В качестве примера можно привести комбинированные лекарственные препараты. Число компонентов в стабильных комбинациях обычно составляет 2—4.
2. Смеси веществ — комбинации веществ, число и соотношение которых может определяться с некоторым приближением. Происхождение смесей веществ обычно связано с одним первоначальным материалом или процессом. Регистрируются они в замкнутом пространстве. Примером смесей могут служить вещества, мигрирующие из полимерных материалов в воздух, воду или пищевые продукты, а также летучие компоненты термоокислительной деструкции и горения полимерных материалов.

Многокомпонентные смеси подразделяют на смеси относительно постоянного и непостоянного состава. К последним относятся смеси постоянные по рецептуре, но непостоянные по количественным соотношениям компонентов, которые изменяются в зависимости от природы источника, температуры и некоторых других факторов. Для решения вопроса о степени постоянства состава многокомпонентных смесей химических соединений рекомендуется применять метод И. М. Трахтенберга и соавторов (1975) как наиболее простой и нетрудоемкий.

1. Стохастические комбинации — комбинации, которые могут содержать неограниченное количество составляющих, независимых друг от друга. Такие комбинации обычно наблюдаются в атмосферном воздухе населенных мест и других объектах биосферы, а также в воздухе современного жилища (в частности, компонентов разнообразных полимерных материалов).

В гигиене применения полимерных материалов исследователь обычно встречается со смесями веществ или их стохастическими комбинациями. Характер комбинации обусловливает выбор веществ для изучения, постановку острых или хронических опытов, дозы воздействующих веществ и др.
В остром опыте с целью изучения комбинированного действия компонентов полимерных материалов, входящих в смеси веществ, возможны два подхода— на основе многофакторного анализа непосредственных
результатов воздействия смеси на организм или путем моделирования этого действия с помощью математических планов эксперимента. Рассмотрим оба подхода на примере изучения комбинированного действия мономеров фенольно-формальдегидных смол — фенола и формальдегида. Результаты опытов по ингаляционному воздействию этих веществ на белых мышей приведены в работе П. А. Нагорного (1979). Оценивались они с помощью многофакторного регрессионного анализа, а также детальным сравнением фактического и ожидаемого эффекта на разных уровнях действия. Особенности регрессионного анализа многокомпонентных смесей достаточно полно изложены в методических указаниях «Математический анализ при токсикологической расшифровке комплекса летучих веществ, выделяющихся в воздух из высокомолекулярных соединений» (Киев, 1975).
В результате регрессионного анализа данных 53 опытов получено уравнение:
(8.)
где у — летальность белых мышей, %- Х1 и х2 — концентрации фенола и формальдегида, мг/м3.
Поскольку оба частных коэффициента регрессии положительны, автор заключает, что действие фенола и формальдегида на величину летальности однонаправленное (синергизм). При детальном анализе полученных данных на разных уровнях выявлены усиление фактического эффекта на уровне выше 50 % летальности и тенденция к антагонизму изученных веществ при снижении уровня воздействия.
Рассмотрим основные методические вопросы определения характера комбинированного эффекта компонентов полимерных материалов с помощью математического планирования эксперимента. Нелинейность зависимости доза — эффект при остром действии химических веществ обусловливает выбор планов, позволяющих описать результаты эксперимента квадратичным полиномом вида:
О.)
К таким планам относятся ортогональные, рототабельные, квази-Д-оптимальные и другие планы второго порядка. В справочнике по планам эксперимента для факторных и полиномиальных моделей (В. 3. Бродский и соавт., 1982) приведены таблицы планов второго порядка для числа независимых переменных п = 1—7. Число опытов в матрице плана для двух переменных варьирует. от 6 до 13, для трех переменных — от 10 до 27, для четырех — от 15 до 42, для пяти — от 21 до 52.
Выбор плана осуществляется, исходя из цели эксперимента, числа веществ в комбинации, уровней воздействия каждого из них, которые намечено изучить, предполагаемого механизма действия и др.
Таблица 8. Матрица планирования и результаты экспериментов по изучению комбинированного воздействия фенола и формальдегида на белых мышей

Результаты обрабатываются методом наименьших квадратов. При этом в случае использования симметричных планов обработка значительно упрощается и может проводиться с помощью малой счетной техники.
При использовании математического планирования в опытах рекомендуется изучать влияние не всей смеси, а только ее ведущих компонентов. Однако понятие ведущий компонент неоднозначно. Его выбор зависит от цели, которую ставит экспериментатор, а также от функционального назначения ведущего компонента в последующей работе (И. М. Трахтенберг и соавт., 1976). В токсикологическом эксперименте, в качестве основного может быть выбрано вещество, оказывающее специфическое воздействие смеси на определенную систему организма. При разработке рекомендаций по снижению токсического действия исходного ПМ ведущим будет наиболее токсичный компонент, удельный вес которого в смеси достаточно велик. Если выбирается показатель для гигиенического нормирования контроля содержания смеси в воздухе, воде или продукте питания, то на первое место выдвигается возможность идентификации вещества, точность и надежность его аналитического обнаружения в данном объекте.
Использование метода математического планирования эксперимента рассмотрим на примере определения комбинированного эффекта мономеров — фенола и формальдегида. Для этого из указанных выше 53 опытов было отобрано 9, позволяющих построить ортогональную матрицу планирования двухфакторного эксперимента (Э В Рафалес — Ламарка, В. Г. Николаев, 1971- табл. 8).
Оба вещества изучали на трех уровнях— минимальном, обозначаемом в кодированном виде (—1), максимальном (+1) и среднем (0). Кодирование факторов, т. е. приведение их к безразмерому виду, осуществляется по формуле:
(10.)
где zi — кодированное значение фактора х, Xo=0,5(Ximax + Ximin) — середина диапазона колебаний фактора Xj, Ai = 0,5(xlmax—Ximrn) — интервал варьирования фактора xi.
После кодирования диапазон изменения каждого фактора будет ограничен величиной (—1), соответствующей ximm, и величиной (+1), соответствующей ximaх. При этом между кодированной величиной и определенным натуральным значением Xi устанавливается однозначное соответствие, которое может быть представлено графически шкалой вида

Декодирование значений факторов, т. е. переход от безразмерного вида к натуральному, осуществляется по формуле:
(11.)
При кодировании фактических концентраций мономеров введен условный момент: в качестве определенного уровня рассматривается диапазон концентраций. Такая условность, на наш взгляд, будет всегда присутствовать при изучении комбинированных эффектов компонентов полимерных материалов в случае их ингаляционного воздействия.
При статистическом анализе результатов получено уравнение:
(12.)
где у — летальность белых мышей, %- X! и х2 — кодированные значения концентраций фенола и формальдегида.
Расчетные значения летальности на основе данного уравнения отличаются от фактических на 10—20 % (в одном опыте отличия достигают 32,9%). Такая точность аппроксимации удовлетворительна в условиях подобных экспериментов и позволяет рассматривать уравнение 12 как модель комбинированного воздействия изученных веществ.
Анализ уравнения с учетом знаков и величин коэффициентов регрессии позволяет сделать следующие заключения:

1. зависимость концентрация — эффект носит нелинейный характер (особенно выраженный для формальдегида);
2. степень выраженности эффекта обоих мономеров в изученных концентрациях примерно одинакова;
3. эффект комбинированного воздействия является взаимозависимым;
4. характер эффекта может быть определен как синергический, менее аддитивного.

Таким образом, уравнение — модель позволяет охарактеризовать практически все стороны комбинированного воздействия, интересующие исследователя. Данная модель получена на основании девяти опытов, т. е. математическое планирование эксперимента позволило в 5 раз сократить затраты сил и средств исследователя, по сравнению с методом многофакторного регрессивного анализа.
А. И. Эйтингон и соавторы (1978) применили описанный метод для изучения комбинированного воздействия газо-аэрозольной смеси основных компонентов, выделяющихся при горении ПВХ (СО, С02, НС1, аэрозоль сажи). При этом получены уравнения, характеризующие зависимость различных показателей состояния организма от исследуемых факторов и их взаимодействия. Анализ этих уравнений позволил заключить, что ведущим компонентом четырехфакторной смеси является СО.
Подчеркивая нелинейность зависимости доза — эффект, И. А. Жолдаков (1986) обосновывает целесообразность использования в острых опытах симплексных планов эксперимента.
Исследование токсичности продуктов сгораниям ПМ, т. е. комбинированного воздействия летучих компонентов и продуктов их трансформации в процессе термодеструкции и горения, представляется одним из существенных аспектов гигиенической оценки ПМ (В. Н. Чекаль, 1980, и др.). Как установлено Williams и Clarke (1982), токсичность смеси может изменяться в 1,5—100 раз как в сторону снижения, так и в сторону увеличения в зависимости от условий сгорания.
Рядом исследователей показано, что преимущественным эффектом комбинированного воздействия компонентов полимерных материалов является суммация. Так, Н. Р. Шепельской (1976) получен суммационный эффект комбинированного действия бутилметакрилата и толуола при внутрижелудочном введении животным на уровне смертельных доз. По данным Я. Г. Двоскина и соавторов (1981), комбинированное действие токсических газовыделений из полимерных материалов (асбоселит, линолеум ТТН, плиты теплоизоляционные ФС-7 и др.) в концентрациях, близких к ПДК для атмосферного воздуха, проявляется как простое суммирование. Аналогичный результат получен Н. Е. Дышиневич (1979) при изучении комбинированного воздействия мезитилена и псевдокумола на белых крыс в круглосуточном хроническом опыте на уровне действующих концентраций.

И. Киселева (1984) изучала характер комбинированного действия фенола и стирола. Беспородные белые крысы (125 шт., 5 групп, из которых одна являлась контрольной) подвергались 4-месячному ингаляционному воздействию в концентрациях, реально встречаемых в атмосферном воздухе. Количественная оценка комбинированного влияния веществ основывалась на определении изоэффективных концентраций при изолированном и совместном их поступлении. Автор пришла к выводу, что характер комбинированного действия фенола и стирола оценивается как независимый. В то же время П. А. Нагорный (1981) подчеркивает, что априорная ориентация на суммацию эффектов компонентов полимерных материалов неправомерна, так как эффект от воздействия на организм комплекса вредных веществ не является суммой эффектов их раздельного влияния. Установленные в настоящее время гигиенические регламенты для комплексов летучих продуктов, определяемых по одному из них, значительно (в 10—50 раз) ниже ПДК этих продуктов при раздельном действии.
Приведенные соображения, наряду с возможностью длительного воздействия компонентов полимерных материалов на организм человека, обусловливают целесообразность постановки хронических опытов. Особенностью их является ограниченное число групп животных и, соответственно, испытываемых концентраций.
При изучении комбинированного действия двух химических веществ в хроническом эксперименте принято использовать 4 группы животных: 1-я — контрольная, 2-я — подвергающаяся воздействию вещества А, 3-я — подвергающаяся воздействию вещества В и 4-я — подвергающаяся комбинированному действию обоих веществ. В случае, если на 4-й группе животных испытываются дозы (концентрации) обоих веществ на тех же уровнях, что и при изолированном воздействии, то 4 опыта могут рассматриваться как единый дисперсионный комплекс. Оценивать эффект рекомендуется путем сравнения результатов опытов при изолированном воздействии веществ и их комбинации на основе данных дисперсионного анализа. Ход анализа и вопросы оценки эффекта изложены в «Методических рекомендациях по планированию эксперимента и оценке эффекта комбинированного действия химических веществ при многократном воздействии» (Киев, 1977).
Дополнительные материалы к характеристике комбинированного эффекта в хроническом опыте могут быть получены при представлении описанных выше 4 опытов в виде ортогональной матрицы полного факторного эксперимента вида 22. В этом случае отсутствие фактора рассматривается как его минимальное значение (—1 в кодированном выражении), а наличие — как максимальное (+1) С целью изучения адекватности получаемой математической модели и возможности прогнозирования на ее основе характера комбинированного эффекта при различных сочетаниях факторов желательно поставить 5-й опыт — при средних уровнях обеих факторов (в кодированном обозначении —0). Модель комбинированного воздействия в данном случае будет представлена уравнением 6.
Естественно, что характер эффекта зависит от стадии процесса (адаптация, компенсация и т. д.) и, следовательно, от времени изучения ответной реакции организма. Время как фактор, влияющий на химические и физические факторы, имеет ряд особенностей. Состояние организма изучается, как правило, в дискретные временные срезы, т. е. в отдельные моменты времени. Если проводится острый опыт, то через часы, сутки. При хроническом опыте — через недели, месяцы. Полученные материалы анализируются на протяжении определенного периода путем графического или статистического (ковариационный, регрессионный) анализа.
Ряд исследователей время включают в общую матрицу плана эксперимента, рассматривая его эквивалентно другим факторам. Однако в большинстве случаев такой подход ошибочен. Это связано с тем, что фактор времени не зависит от моделируемых в эксперименте химических и физических факторов, так как суммарная нагрузка их воздействия изменяется с увеличением временного периода. В данном случае нарушается одно из существенных условий планирования эксперимента: в план закладываются закоррелированные факторы, что изменяет его оптимальность по ряду критериев — ортогональности, композиционности и др.
К числу возможных методов изучения комбинированного воздействия комплекса веществ, выделяющихся из полимерных материалов, относится хронический эксперимент на животных, помещаемых в камеры- генераторы (А. Н. Боков, 1968). На основе этого метода выполнены исследования по гигиенической оценке большого числа Г1М, используемых в строительстве. Так, А. Н. Боковым (1973) исследованы конструкции пола, состоящего из ДСП типа ПТ-3-АБ на основе карбамидной смолы марки М-19-62, дифенолкетоновой мастики и ПВХ линолеума. В воздушной среде камер-генераторов обнаруживались в небольших количествах формальдегид, ацетон и дибутилфталат. Затравка крыс проводилась круглосуточно в течение 157 дней при отношении площади поверхности конструкции к объему камеры-генератора 0,4 м2/м3, температуре 30 °С и кратности воздухообмена 1,2. К началу затравки с момента изготовления конструкции прошло 4,5 мес, а с момента изготовления ДСП — около года. В различные сроки затравки у животных регистрировались единичные статистически достоверные изменения некоторых гематологических показателей, содержания сахара в крови и соотношении мышц-антагонистов. Автор трактует испытанные концентрации как пороговые.
Камеры-генераторы большого объема позволяют проводить кратковременные наблюдения над людьми с целью определения рефлекторного влияния вредных веществ, выделяющихся из полимерных материалов.
Таким образом, моделирование комбинированного воздействия компонентов полимерных материалов с помощью камер-генераторов имеет ряд преимуществ. В то же время такой подход требует значительного объема исследований для каждой модификации полимерных материалов, каждой конструкции, не позволяя при этом выявить механизм комбинированного воздействия и дать оценку характеру эффекта (антагонизм, потенцирование и т. д.). Поэтому целесообразно сочетание санитарнохимических исследований в камерах-генераторах с последующим (в случае необходимости) изучением комбинированного эффекта ведущих компонентов смеси на основе математического планирования эксперимента. Использование камер-генераторов показано при исследовании стохастических комбинаций, создаваемых комплексом различных полимерных материалов.
Перебор вариантов комбинированного действия даже наиболее часто встречаемых компонентов полимерных материалов практически невозможен. Отсюда поиск путей прогнозирования эффекта комбинированного действия, исходя из химических, физических и физиолого-биохимических представлений. Первый путь — это прогноз комбинированного эффекта на основе физико-химических данных о природе соединений, возможном химизме и кинетике их реакций в окружающей среде. Второй — выявление и учет закономерностей физического взаимодействия, например, повышение летучести аэротропных смесей, изменение скорости всасывания веществ в пищеварительном канале. В основе третьего пути лежит знание механизмов взаимодействия токсических веществ с биохимическими системами организма.
Возможные пути предсказания комбинированного эффекта достаточно полно рассмотрены В. В. Кустовым и соавторами (1975). Поэтому мы остановимся только на одном аспекте проблемы: возможности активации или торможения метаболизма одного яда другим в процессе их трансформации на уровне микросомальных энзимов. Авторы считают, что именно на этом пути будут обнаружены общие закономерности, которые с учетом токсичности продуктов метаболизма позволяют предсказывать характер комбинированного действия химических веществ. К аналогичному выводу пришли участники специального семинара по комбинированному эффекту ксенобиотиков (1983).
Несомненна целесообразность дальнейшего углубленного познания биохимических механизмов токсического действия и раскрытие путей его модификации при воздействии нескольких веществ. Результаты этих исследований будут основой для прогнозирования эффекта комбинированного воздействия.
Обобщение современных методических подходов к изучению комбинированного действия, уточнение терминов и определений типа ответной реакции осуществлено при разработке методических рекомендаций («Постановка исследований по изучению характера комбинированного действия химических веществ, загрязняющих производственную среду, с целью прогнозирования неблагоприятного влияния на здоровье работающих и определения подходов к гигиеническому нормированию» М., 1986 г.). Учитывая, что тип комбинированного действия зависит от уровня воздействующих доз или концентраций, показателей ответной реакции организма и других факторов, вводится понятие об основном или определяющем типе комбинированного действия. Под основным типом понимается такой вариант комбинированного действия, который, наблюдается при влиянии пороговых доз или концентраций, а также при уровнях воздействия, вызывающих развитие хронической интоксикации. При этом большое значение придается данным о характере ответной реакции «критических», наиболее поражаемых органов и систем, исходя из механизма действия изучаемых компонентов и особенностей их токсикокинетики (Б. А. Кацнельсон, С. М. Новиков, 1986).
Заключение о типе комбинированного влияния является основанием для гигиенической оценки ПМ, определенного изделия или объекта среды. В случае выявления антагонистического типа комбинированного действия ПДК или ДУ для компонентов смеси остаются такими же, как и при изолированном воздействии. В случае установления синергизма (менее аддитивного или аддитивного) необходимо проводить корректировку гигиенических регламентов по формуле А. Г. Аверьянова при использовании в качестве критериев гигиенических нормативов:
(13.)
Такой подход предусмотрен ГОСТ 12.1.005—76 «Воздух рабочей зоны». При одновременном содержании в воздухе рабочей зоны нескольких вредных веществ однонаправленного действия сумма отношений фактических концентраций каждого из них в воздухе помещений к их ПДК не должна превышать 1.
В случае синергизма более аддитивного эффекта (потенцирование) мы придерживаемся мнения В. В. Кустова и соавторов (1975), Ю. С. Кагана (1981) о необходимости количественной оценки и соответствующей корректировки комбинированного эффекта. С этой целью предложено использовать коэффициенты потенцирования при характеристике среды по формуле Аверьянова:
•             (14.)
Если эффект потенцирования выявлен на стадии синтеза ПМ, наиболее целесообразно внесение корректив в его состав путем исключения или снижения концентрации компонентов, обусловивших неблагоприятный эффект. Когда изучаемый ПМ уже внедрен в производство, рекомендуется организовывать клинико-гигиеническое наблюдение за производственной средой и состоянием здоровья работающих.
По данным П. А. Нагорного (1985), в случае комплексов практически постоянного состава концентрация продукта, который был ведущим в остром опыте, будет отражать уровень концентрации всего комплекса и в хроническом эксперименте, даже если роль этого продукта в токсичности в той или иной степени изменится. Поэтому правомерно осуществлять гигиеническое нормирование комплекса летучих веществ по ведущему продукту, определенному по результатам острых опытов.