Количественные критерии токсичности - токсикология полимерных материалов
Говоря о количественных критериях токсичности на смертельном уровне, остановимся на дискуссионном вопросе об использовании показателей максимально переносимых (ЛД0) и абсолютно смертельных (ЛД100) доз. Многие исследователи не рекомендуют пользоваться этими показателями, поскольку они, не имея вероятностного значения, не являются точными и не дают нужной информации о токсичности изучаемых веществ. Однако необходимо отметить, что какая-то особая точность, в том числе и ошибка, при установлении смертельных доз не имеет практического смысла, так как эти параметры указывают только на порядок величин, используемых в подострых и хронических опытах. При установлении эффективных доз в опытах, когда испытывают несколько их вариантов, снова могут появиться ошибки и неточности, которые не связаны с величиной среднесмертельной дозы, а являются ошибками и неточностями подострого или хронического опыта.
Многие исследователи считают, что точность и информативность ЛД50 можно существенно повысить, если более полно охарактеризовать конкретные условия эксперимента (пол, возраст, вид животных, концентрация и объем растворов, растворитель и др.) и максимально их унифицировать. К сожалению, указанные данные редко приводятся в научных работах и применяются различные способы определения среднесмертельных доз. Таким образом, особой точности нельзя ожидать даже от ЛД50, установленной методом пробит-анализа, причем по причинам, не зависящим от характера математической обработки результата. Известно, что есть способы придать максимально переносимой дозе вероятностное значение, т. е. рассматривать ее для 95 % и 99 % уровня значимости (определив их на логарифмической пробитной кривой). ЛД01 или ЛД05 дают представление о максимально переносимой дозе. В. Н. Ракитский и Ю. С. Каган (1983) в качестве минимальной летальной дозы предлагают вероятностную ЛД2,5. По мнению других авторов, определение ЛД50 с точными доверительными границами является расточительным в отношении количества животных, так как ее статистическая сверхточность снижается из-за влияния других факторов (A. Rowan, 1983). Часто исследователи ссылаются на то, что величина ЛДо будет уменьшаться с увеличением количества взятых в опыт особей, что находит свое объяснение в вариабельности индивидуальной чувствительности животных к ядам. При этих же условиях величина ЛД100, естественно, должна возрастать. Однако это возражение теряет убедительность, если определять ЛД0 не подбором не вызывающей гибели дозы, а расчетным путем — в месте пересечения кривой летальности с осью абсцисс.
Нельзя не учитывать и то обстоятельство, что графическое определение ЛД0 и ЛД100 должно оказаться значительно более точным, чем графическое обнаружение ЛД50, так как S-образная кривая летальности в начальной и конечной части представлена почти прямыми линиями.
Таким образом, если точность установления ЛД0 (или ЛД01) практически не отличается от точности определения ЛД50, то возникает вопрос, какую информацию мы утрачиваем, не используя первый из указанных количественных критериев токсичности.
Как известно, такие параметры, как зона токсического действия или тангенс угла наклона прямой летальности, редко используются в водной и пищевой токсикологии. Поэтому 2 вещества с примерно одинаковой ЛД50 должны относиться к одному и тому же классу токсичности. Но если максимально переносимые дозы этих веществ будут отличаться между собой хотя бы на один порядок, что встречается часто, то наклон прямых летальности и токсичность этих веществ по этому критерию будут оценены иначе. Д. Г. Хорсфолл (1978) считает, что ЛД50 дает лишь статическую картину, а наклон кривой — динамическую.
Другим доводом в пользу необходимости использования максимально переносимой дозы являются ситуации, когда 100 % или 50 % гибели животных в остром опыте не удается достичь ввиду низкой токсичности вещества. В этом случае при проведении токсикометрии ЛД0 может оказаться единственным ориентиром в выборе доз для дальнейших исследований.
В последнее время количественные критерии острой токсичности, в частности среднесмертельные дозы, все чаще используют в уравнениях для расчета пороговых доз и ПДК. Так как на шкале количественных параметров токсичности ЛД0 расположена значительно ближе к порогу хронического действия (не только в графическом, но, главным образом, в биологическом смысле). С нашей точки зрения, уместным будет использование в расчетных уравнениях ЛД0 вместо ЛД50. По-видимому, это также является перспективным направлением применения ЛД0.
Приведенные соображения позволяют рекомендовать использование максимально переносимой дозы (ЛД0) в качестве одного из основных количественных критериев токсичности, устанавливаемых в остром опыте. Есть основания согласиться с мнением М. L. Tattersall (1982), считающего, что хотя ЛД0 менее точна, чем ЛД50, информативность ее и практическое значение для токсикологической оценки химических веществ больше чем ЛД50, представляющей в этом смысле только академический интерес.
В Швеции (1985) состоялся первый международный симпозиум, посвященный использованию ЛД50 и ее возможным альтернативам, на котором отмечалось, что стандартное определение среднесмертельной дозы требует расхода большого количества животных.
Симпозиум привлек внимание исследователей к альтернативным в отношении ЛД50 методам, позволяющим получить информацию того же самого или лучшего качества, используя меньшее количество животных (A. Rowan, 1983). Замена ЛД50 более тонкими и точными методами, по мнению Е. Paget (1983), является фундаментальной проблемой, с которой сталкивается наука при проведении токсикологических исследований и гигиенической регламентации содержания химических веществ в окружающей среде.
Тем не менее, как справедливо подчеркивает З. И. Жолдакова (1985), вопрос о методах изучения смертельных эффектов веществ нецелесообразно сводить к альтернативе ЛД50 или ЛД0, а в зависимости от поставленных задач объем опытов, объекты исследований и рассчитываемые параметры могут широко меняться.
В соответствии с реальными условиями поступления ингредиента ПМ с воздухом, водой, пищей или через кожу среднесмертельную дозу (концентрацию) определяют при внутрижелудочном, ингаляционном или кожном пути введения (не менее чем на 2 видах животных).
При выявлении смертельных доз вещества, растворимые в воде и масле, вводят в желудок в виде растворов, нерастворимые — в виде эмульсий или суспензий. В качестве эмульгаторов используют ОП-7, ОП-10 или молоко. Эмульсию готовят, смешивая эмульгатор с навеской исследуемого вещества в определенном отношении, постепенно добавляют воду и тщательно растирают полученную массу. Контрольным животным вводят эмульсию, содержащую только эмульгатор. Мышам вводят 0,5—1 мл жидкости, крысам 3—8 мл, гвинейским свинкам — 4—6 мл, кроликам — 100 200 мл (в зависимости от массы тела животных). При изучении острой токсичности для мышей фосфорорганических соединений Е. А. Ершова и соавторы (1975) показали, что объем вводимой в желудок жидкости влияет на показатели токсичности. Авторы рекомендуют вещество вводить в объеме 0,2—0,6 мл. Поскольку крысы едят ночью, большое количество пищи рано утром по сравнению с послеполуденным временем в их желудке может изменить острую токсичность при в/ж введении. С целью устранить подобное влияние в эксперимент необходимо брать животных, которые ночью могут не питаться. ЛД50, определенная натощак, обычно в 2—3 раза ниже, чем у кормленых животных.
Вещество вводят в желудок мелких лабораторных животных металлическим зондом, кроликам, кошкам и собакам — резиновым зондом. Пищу животным следует давать не ранее, чем через 3—4 ч после введения вещества. Введение вещества с помощью зонда обеспечивает точную дозировку и позволяет избежать местного действия его на слизистые оболочки полости рта и пищевода. В зависимости от токсичности вещество можно вводить в чистом виде или в растворе. Иногда прибегают к нейтрализации соединений кислого или щелочного характера. Имеются сообщения о том, что ПАВ, используемые в качестве эмульгатора при введении химических веществ в желудок, повышают их токсичность из-за ускорения процесса всасывания.
При токсикологической оценке строительных полимерных материалов вещество или комплекс газовыделений вводят через дыхательные пути. Моделирование такого рода интоксикаций производится с помощью затравочных камер объемом 100—1000 л. В настоящее время используют камеры различных конструкций в зависимости от задач эксперимента и физико-химических свойств изучаемого вещества (И. В. Саноцкий, 1970). В затравочные камеры летучие вещества подаются в динамическом режиме, для чего необходимо централизованное снабжение всего камерного хозяйства сжатым воздухом и создание системы вытяжной вентиляции. При изучении токсичности комплекса газовыделений из строительных полимерных материалов затравочные камеры подключают к камерам-генераторам. В исследованиях по экспериментальному обоснованию ДУ миграции отдельных летучих компонентов из строительных полимерных материалов в затравочные камеры подают заданные концентрации вещества в воздухе. Подопытных животных загружают в камеры, убедившись, что достигнута и стабильно поддерживается необходимая концентрация вещества в воздухе. Количество подающегося в камеры воздуха измеряют с помощью реометров и ротаметров. Реометр-регулятор позволяет поддерживать поток воздуха на заданном уровне при изменении режима работы воздухоснабжающих устройств. При установлении ЛK50 экспозиция для мышей должна равняться 2 ч, для крыс и животных других видов — 4 ч. Животные наблюдаются 2—4 нед.
Накожное нанесение вещества при определении ЛД50 должно строго регламентироваться, так как величины среднесмертельных доз находятся в обратной зависимости от площади аппликации: чем больше площадь аппликации, тем меньше ЛД50 (Ю. И. Кундиев, 1978). Участок нанесения вещества у белых крыс — 2X2 см2, у кроликов — 4X5 см2.
При отсутствии гибели животных от нанесения вещества на кожу для изучения кожно-резорбтивного действия можно использовать метод погружения хвоста (мыши или крысы) в пробирку с раствором исследуемого вещества.
После окончания затравки описывают внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение их к пище, подвижность, ритм и частоту дыхания, а также характер и выраженность симптомов интоксикации, их длительность, сроки и возможные причины гибели. Исследуют функциональные и биохимические показатели, внутренние органы и ткани.
Различные методы расчета среднесмертельных доз и концентраций требуют выполнения определенных условий опыта. Методы Беренса и Кербера предусматривают одинаковое количество животных в каждой группе, метод Беренса — одинаковые интервалы между величинами доз. Более точным по сравнению с упомянутыми методами является метод пробит-анализа. При соблюдении равных интервалов между вводимыми дозами для определения среднесмертельных доз можно использовать достаточно простой и точный графический метод Асковица (В. О. Шефтель, 1981).
На нецелесообразность скрупулезного уточнения ЛД50 и ее ошибки, а следовательно, и громоздких вычислений, связанных с проведением пробит-анализа, указывает Б. М. Штабский. Автором описан прием, упрощающий определение среднесмертельных доз и концентраций (Б. М. Штабский и соавт., 1980). Суть его заключается в том, что в диапазоне доз ЛД0 — ЛД100 график зависимости частоты летального исхода (в %) от дозы имеет вид сигмоидной кривой, причем сущность пробит-анализа сводится к выпрямлению симметричной кривой на основе ее сходства с кривой нормального распределения путем выражения доз в единицах среднего квадратического отклонения (а). Затем число таких единиц увеличивают для удобства на 5, получая соответствующие пробиты, каждый из которых эквивалентен строго определенному проценту летальности. Считают, что зависимость между пробитами и логарифмами доз (дозами) близка к линейной. Прямая строится по 3 средним точкам, которые хорошо ложатся на прямую и без обращения к пробитам, так как в своей средней части любая сигмоидная кривая всегда может быть аппроксимирована прямой. При этом в отношении такой прямой сохраняет силу условие 2ст = ЛД84 — ЛД16, а средняя ошибка (м) среднесмертельной дозы по Миллеру и Тейнтеру вычисляется по формуле
где N — общее число животных в группах, в которых погиблоили выжило хотя бы одно животное (доверительные границы ЛД50 находят при р = 0,05 для числа степеней свободы t = N—1). Значение ЛД50 и ЛД100 в расчет не принимаются.
Следовательно, объективно пробит-анализ излишен, а для оценки ЛД50 достаточно испытать не более 3 доз вещества, одна из которых приводит к гибели менее 50 % животных, другая — более 50 %, а третья является промежуточной между ними. В этом диапазоне доз зависимость процента летальности (у) от дозы (х) практически имеет вид прямой и может быть описана уравнением прямой с угловым коэффициентом (а):
(1)
где b — свободный член.
Значения а и b находят из нормальной системы Гаусса: 
(2) 
(3)
где X1 и х2 — значения двух крайних из 3 испытанных доз (приводящих к гибели менее и более 50 % животных соответственно)- y1 и у2 — соответствующие проценту летальности- п — число испытанных доз, равное 3.
Зная а и б, решают уравнение 1 относительно х:
(4)
Затем последовательно подставляя в 4 уравнение значения у1, равные 50, 84 и 16 %, находят ЛД50, ЛД84 и ЛД]6 и далее, как обычно, рассчитывают о, m, mt (t-критерий Стьюдента).
Пример расчета. При определении ЛД50 оловоорганического стабилизатора диоктилоловокарбоксилата методом пробит-анализа получена величина среднесмертельной дозы для белых крыс, равная 5,4 г/кг. Величины летальных эффектов распределились следующим образом:
Ошибка по сравнению с методом пробит-анализа составила около 3 %.
Т. В. Пастушенко и соавторы (1985) предложили экспресс- экспериментальный методический прием определения ЛД50 химических веществ и их доверительных интервалов, который требует незначительных затрат времени и ограниченного числа животных. Этот метод более прост по сравнению с табличным методом Б. В. Прозоровского и соавторов (1978, 1980). Он позволяет с помощью одной таблицы определять ЛД50 химических веществ и их доверительные границы в широком диапазоне выраженности токсических свойств.
При определении ЛД50 на нескольких видах животных в целях экономии времени и животных часто используют метод одной точки. Установление ЛД50 методом одной точки по Ван дер Вардену (1940) основано на предположении, что угол наклона прямых летальности у животных разных видов примерно одинаков. На другом виде, животных определяют точку, соответствующую полученному эффекту гибели от введенной дозы, и через нее проводят прямую, параллельную прямой летальности от введения вещества
на первом из испытанных видов животных. ЛД50 выявляют графическим способом. И. В. Саноцкий (1970) и другие авторы обнаружили достаточное соответствие при сопоставлении среднесмертельных величин, определенных по описанному методу, с данными развернутых опытов. Авторы рекомендуют использовать метод Ван дер Вардена для установления среднесмертельных концентраций, половой и возрастной чувствительности к воздействию химических веществ для белых мышей и крыс. Информация, полученная в результате острого опыта, используется, как правило, не полностью, так как не учитываются колебания временного параметра, обусловленные индивидуальной чувствительностью животных к веществу.
В последнее время применяют такой показатель острой токсичности, как среднее время гибели половины подопытных животных (ЕТ50). Этот параметр определяется с доверительными границами и имеет вероятностный характер. На значимость среднего времени гибели животных впервые указал Б. М. Штабский (1980). Г. Н. Красовский и соавторы (1982) предложили метод определения ЕТ50, в котором за основу берется таблица учета времени и частоты гибели животных в остром опыте по суткам или часам наблюдения. По таблице рассчитывают ЕТ50 для каждой дозы. Полученные величины наносятся на график с логарифмической сеткой и аппроксимируются прямой. Из точки на прямой, соответствующей ЛД50, опускают перпендикуляр до пересечения с осью абсцисс, где и определяется величина ЕТ50 — среднее время гибели животных от введения им ЛД50. Т. В. Пастушенко и соавторы (1983) применили расчетный метод вероятностной оценки среднеэффективного времени гибели животных от среднесмертельной дозы вещества. Для расчета используют линейное уравнение регрессии:
у = а + бх,
где а и b — коэффициенты регрессии- у — доза (Д)- х— среднее время гибели животных.
Коэффициенты регрессии а и b устанавливают методом наименьших квадратов и по уравнению находят х (или ЕТ50), подставляя в него вместо у значение ЛД50. Доверительные границы ЕТ50 определяют таким же образом, подставляя вместо у доверительные границы ЛД50. Авторы предлагают пользоваться таблицей учета времени и частоты гибели животных, предложенной ранее Г. Н. Красовским и соавторами (1982). На основании этой таблицы расчетным путем составляется рабочая таблица для определения коэффициентов регрессии. Дозы (Д), вызывающие гибель животных, и среднее время гибели животных (Т) от каждой из введенных доз вещества выражают в натуральных величинах. j
Приведенный метод определения ЕТ50, по данным Т. В. Пастушенко и соавторов (1982), хорошо совпадает с графическим методом Г. Н. Красовского и соавторов (1982). Величина ЕТ50 является интегральным показателем и учитывает колебания временного параметра, связанные с индивидуальной чувствительностью животных к действию вещества в дозах ниже и выше ЛД50. Расчет ЕТ50 является достаточно точным способом оценки кумулятивности веществ.
Г. Н. Красовский и соавторы (1982) предложили уравнения, в которые введены индивидуальные коэффициенты, учитывающие степень выраженности кумулятивных свойств различных классов химических соединений.
Подострая токсичность охватывает эффекты, вызванные значительным воздействием, ограниченным во времени.
Задачей подострого опыта является: 1) оценка кумулятивных свойств вещества- 2) выявление пораженных органов, функций и систем- 3) уточнение механизма действия вещества- 4) выбор доз для хронического опыта- 5) изучение зависимости доза — эффект.
При постановке подострых опытов необходимо определить на одном или нескольких видах животных уровни воздействия, при которых по избранным морфологическим, физиологическим, биохимическим и другим параметрам выявляется неблагоприятный эффект от повторного воздействия вещества. Важнейшей задачей подострых опытов является изучение и оценка кумулятивного эффекта. Для рационального планирования хронического эксперимента необходимо выявить органы и системы, которые повреждаются в результате кумуляции.
Во время проведения подострых опытов определяют динамику изменения массы тела животных, потребление корма, фиксируют проявляющиеся признаки интоксикации и причины смерти. С помощью необходимых показателей оценивают физиологическую активность и функцию важнейших органов и систем. В случае необходимости проводят дополнительные биохимические, иммунологические, гистологические и другие исследования, а также изучают влияние вещества на репродуктивную функцию животных. Исследование кумулятивных свойств вещества направлено на выявление значения фактора времени в развитии интоксикации.
