Бактериологические и серологические методы исследования при инфекционных болезнях
Установление этиологии заболевания облегчает и уточняет постановку диагноза. Лабораторное исследование является одним из многих объективных методов, и пользоваться им следует рационально. Неправильная оценка данных лабораторного исследования может привести к диагностическим ошибкам. Так, получение отрицательного результата — еще не основание для исключения предполагаемого диагноза. Отрицательный результат может быть следствием неправильного забора материала, несвоевременной доставки его в лабораторию, несовершенной методики бактериологического исследования. Если материал берется не в первые дни заболевания, а уже на фоне этиотропной терапии, возбудитель может быть не выделен из-за угнетения его жизнеспособности или гибели под действием проводимого лечения. Поэтому низок удельный вес подтвержденных бактериологически менингококковых Менингоэнцефалитов, так как даже однократное введение пенициллина обычно делает бесполезным дальнейшее бактериологическое исследование. Положительные результаты бактериологических исследований могут быть определяющими для постановки диагноза, например при выделении гемокультуры палочки брюшного тифа, паратифов А и В, при обнаружении менингококков, пневмококков, палочки инфлюэнцы в спинномозговой жидкости. Однако нахождение микробов в других субстратах не всегда позволяет точно установить диагноз. Так, если дифтерийная палочка, менингококки, пневмококки и палочка инфлюэнцы выделяются из носовой части глотки, слизи из зева и носа, а сальмонеллы — из кала, то это может быть заболевание другой этиологии у бактерионосителей названных микробов. Наибольшие трудности для интерпретации положительных находок при бактериологическом исследовании представляет выделение условно-патогенных видов бактерий, широко распространенных среди семейств Micrococсаеае и Enterobacteriaceae. Поэтому при постановке диагноза заболеваний, вызванных условно-патогенными возбудителями, надо проявлять осторожность и исходить из 4 критериев: многократности обнаружения данных видов, массивности их роста в посевах на плотные питательные среды, антигенной и фаговаровой однородности выделяемых субкультур и диагностического нарастания титров гомологичных антител при серологических исследованиях.
Микробиологические методы исследования делятся на методы прямого обнаружения возбудителя в организме больного — бактериоскопическое и бактериологическое исследования- методы косвенного доказательства наличия возбудителя в организме больного — серологические исследования, направленные на обнаружение специфических антигенов в инфицированном материале или антител в сыворотке крови и различных секретах организма больного.
Бактериоскопическое исследование крови, мочи, спинномозговой жидкости, слизи из зева и носа, кала и различных патологических субстратов на присутствие возбудителя применяют при многих инфекционных болезнях. Этот метод имеет довольно ограниченное применение, хотя и очень важен. Он используется, в частности, для обнаружения в крови возбудителей малярии, возвратного тифа, лептоспироза. Спинномозговую жидкость исследуют при гнойном и туберкулезном менингите, слизь из зева и носа — при дифтерии, ангине Венсана, кал — при амебиазе, балантидиазе, лямблиозе- мочу — при лептоспирозе. Палочки чумы, сибирской язвы можно увидеть в пунктате чумного бубона и мазках-отпечатках, взятых из сибиреязвенного карбункула- при микроскопии мазка пунктата из костного мозга и селезенки, грануляций из язвы можно обнаружить лейшмании- в мокроте — микобактерии туберкулеза. Преимущество бактериоскопического метода заключается в его быстроте. Результаты анализа могут быть получены через несколько часов. При некоторых заболеваниях (малярия, эпидемический цереброспинальный менингит и др.) возбудители могут быть обнаружены в организме больного уже в 1-й день болезни, что очень важно для своевременной диагностики и лечения. Значительно расширились возможности, бактериоскопической диагностики благодаря обработке препаратов специфическими сыворотками, содержащими антитела к данному возбудителю, меченные флуорохромами (иммунофлуоресцентный метод) или ферментами (иммуноферментный метод). При этом меченые антитела соединяются с антигеном, который выявляется при иммунофлуоресцентном методе под люминесцентным микроскопом, а при иммуноферментном методе — по окрашиванию продукта ферментативной реакции после введения субстратно-индикаторной смеси.
Бактериологический метод диагностики основан на выделении возбудителя из крови, спинномозговой жидкости, мокроты, слизи из зева и носа, кала, мочи, желчи больного, а при летальных исходах — из кусочков органов, которые засевают на специальные питательные среды. Бактериологическая диагностика широко используется для исследования слизи из зева и носа на дифтерийные бактерии, для выделения возбудителей кишечных инфекций (например, холеры, дизентерии, сальмонеллезов, эшерихиозов) из кала больного, возбудителей пневмонии — из мокроты и в других случаях. При этом учитывают особенности предполагаемой инфекции, место избирательной локализации возбудителя и пути его выделения в окружающую среду. Исследование дает положительные результаты уже в первые часы или дни болезни. Однако окончательный ответ лаборатория при большинстве инфекционных болезней сообщает лишь через 2—4 дня, а при бруцеллезе, туберкулезе — через 3—4 недель. Это зависит от сроков, требующихся для роста микроорганизмов и их идентификации (биохимической и серологической). Каждый микроб для своего роста требует соответствующей питательной среды. В зависимости от того, какой микроб предполагают выделить (что определяется при клиническом и эпидемиологическом обследовании больного) , выбирают соответствующую питательную среду. Иногда посев производят одновременно на несколько питательных сред. Ценность результатов бактериологических исследований во многом определяется тем, правильно ли взят материал у больного и правильно ли он доставлен в лабораторию. Инфекционный материал собирают в стерильную посуду, соблюдая правила асептики.
В табл. 1 приведены основные данные о сроках взятия материала для исследования и средах для первичного посева.
Материал для исследования в самые короткие сроки должен быть доставлен в лабораторию. Если такой возможности нет, его нужно сохранять в холодильнике при +4 °С или добавлять консервант. В некоторых случаях посев необходимо производить ex tempore (при коклюше, менингококковой инфекции, гонорее). После выделения и идентификации возбудителей, как правило, определяют их чувствительность к антибиотикам и другим химиопрепаратам. Это во многом помогает скорректировать терапию и подобрать эффективное этиотропное средство.
При инфекциях, вызываемых условно-патогенными бактериями, выделение их из субстратов, в норме не являющихся стерильными (кал, моча, мокрота и др.), не рассматривается как безусловное доказательство этиологической роли этих микроорганизмов в генезе заболевания. Обсемененность эндогенной микрофлорой у больных значительно выше, чем у бактерионосителей. Поэтому только количественный учет высеянных микроорганизмов животных заражают подозрительным материалом (биопроба на мышах при пневмококковой инфекции).
Таблица1 Сроки взятия материала при бактериальных инфекциях
Инфекция | Материал для исследования | Срок взятия материала | Среда для первичного посева |
Бруцеллез | Кровь на гемокультуру | С 1-го дня до конца лихорадки | Бульон с глюкозой и глицерином, бульон D- печеночныйи кровяной агар |
Брюшной тиф и пара-тифы Аи В | Кровь на гемокультуру | С 1—2-го дня болезни до конца лихорадки | Среда Рапопорт, желчный бульон, бульон с 1 % глюкозы, стерильная дистиллированная вода |
для серологического исследования | С 1-го дня 2—3 раза с недельным интервалом | — | |
Испражнения | Конец 2-й, начало 3-й недели и конец реконвалесценции | Среды Вильсона — Блера, Левина, Эндо- среды обогащения Мюллера,Кауфмана | |
Моча | Конец 2-й, начало 3-й недели и конец реконвалесценции | Среды Вильсона — Блера, Левина, Эндо- среды обогащения: Мюллера,Кауфмана | |
Возвратный тиф | Кровь для микроскопии | Со 2-го дня | — |
Газовая гангрена | Отделяемое раны, ткань,кровь | С 1-го дня до конца заболевания | Глюкозо-кровяной агар, среды Тароцци, Виллиса и Хобса, Вильсона — БлераАнаэробные условия! |
Гонорея | Экссудаты из мочевого канала, шейки матки,конъюнктивы | С 1-го дня до конца заболевания | Кровяной, шоколадный, сывороточный агары |
Дизентерия | Испражнения | С 1-го дня до концазаболевания | Среды Плоскирева, Эндо, Левина- селенитовая среда обогащения |
Дифтерия | Пленка, мазок из глотки Видео: b lf t Al yev, A. Алыев - вспышке бруцеллеза дошла до финала 4 февраля 2014 | С 1-го дня до концазаболевания | Кровяной агар, среды Леффлера, Ру, Бучина, кровяные среды стел-луритом, полужидкая сывороточнаясреда обогащения с теллури-том |
Инфекции, вызываемые бактериями из рода Haemophilus | Слизь из зева, мокрота, спинномозговая жидкость | С 1-го дня до концазаболевания | Агары с гретой кровью по Левинталю, с нативной кровью, среда Файлдса |
Коклюш | `Слизь из зева, мазки из глотки, гортани | С 1-го дня до конца заболевания Видео: b lf t Al yev, Абульфат Алыев -Загадки живой клетки Иммунитет | |
Легионеллез | Мокрота, плевральнаяжидкость, бронхиальный смыв, легочная ткань | Угольно-дрожжевой агар, ФЖ агар- биологическая проба нагвинейских свинках | |
Кровь для серологического исследования (реакция непрямойиммуно-флуоресценции) | С 1-го дня 3—4 раза с недельным интервалом | ||
Лептоспироз | Кровь на гемокультуру для серологического исследования | С первых дней | Сывороточный бульон |
Моча | На протяжении всей болезни |
Серологические исследования. Реакции иммунитета широко используют для диагностики инфекционных заболеваний у человека. Различают реакции, в которых по известным антителам определяют неизвестные антигены, и реакции, направленные на поиск неизвестных антител по известным антигенам. Перспективны методы, основанные на обнаружении в ранний период болезни микробных антигенов в различных субстратах. Эту задачу лишь отчасти может разрешить реакция связывания комплемента (РСК). Более чувствительным методом оказалась реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) с антительным эритроцитарным диагностикумом, которая применяется для диагностики дизентерии и некоторых других инфекций. При этой реакции находящийся на поверхности танизированных эритроцитов специфический иммуноглобулин связывается с гомологичным антигеном. Эритроциты человека и животных (нативные и формалинизированные), предварительно обработанные танином, приобретают повышенную способность адсорбировать на своей поверхности белковые субстанции. В качестве адсорбентов кроме эритроцитов используются латекс, коллодий, бентонит и др. Реакция латекс-агглютинации применяется для выявления антигенов пневмококков, палочки инфлюэнцы, менингококков. При положительной реакции частицы латекса выпадают в осадок. Практическое значение приобретает такой высоко чувствительный и специфичный метод определения бактериальных антигенов, как встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ). В последние годы для диагностики различных инфекций стала применяться реакция коагглютинации. Это реакция между антигеном и антителами, фиксированными на поверхности золотистых стафилококков, содержащих протеин А (компонент клеточной стенки большинства штаммов золотистых стафилококков). Последний обладает способностью соединяться с Fc-фрагментом Ig G. В результате образуется иммуносорбент по типу антительного диагностикума, который вступает в реакцию с гомологичным антигеном за счет свободных Fab-фрагментов иммуноглобулина. Визуально это выражается феноменом агглютинации стафилококка. Применение реакции коагглютинации перспективно для быстрого обнаружения бактериальных антигенов в крови, спинномозговой жидкости, мокроте и другом материале.
В лабораторной практике применяют также иммунофлуоресцентный метод Кунса, когда с помощью флуоресцирующего красителя, присоединенного к молекуле антитела, реакция антиген—антитело становится видимой в люминесцентный микроскоп. В отличие от других серологических реакций, когда о соединении антигена с антителом судят по вызываемому им вторичному эффекту (агглютинации, преципитации и др.), иммунофлуоресцентный метод позволяет непосредственно наблюдать происходящую реакцию и, следовательно, судить о наличии и локализации антигена.
В настоящее время большое распространение приобретает иммуно-ферментный метод, обладающий высокой чувствительностью и универсальностью. Этот метод основан на определении антигенов при помощи иммуно-
сорбента, связанного с ферментом. Такая реакция между антигеном и антителом получила название ELISA (enzymelinked immunosorbent assay). Например, если надо обнаружить антиген в клетке при наличии соответствующего гомологичного антитела, можно соединить фермент ковалентно с антителом и затем этим антителом, меченным ферментом, прореагировать с антигеном.
Самый чувствительный, позволяющий обнаружить малое содержание антигенов (0,5 нг/мл),— радиоиммунный метод, однако он требует специального оборудования.
Перечисленные методы имеют ряд преимуществ перед бактериологическим. Это методы экспресс-диагностики, позволяющие определить антигены возбудителей в течение нескольких минут или часов. Несмотря на гибель бактерий после проводимой этиотропной терапии, антигены возбудителей могут персистировать в организме от 3 до 4 недель и выявляться данными методами. Тем не менее следует учитывать, что существует широкое антигенное родство между родами и видами внутри каждого семейства бактерий и даже среди различных семейств. Это может привести к получению ложноположительных результатов. Определение антигенов бактерий не позволяет установить чувствительность возбудителей к антибиотикам, что также снижает значимость этих методов.
Серологические реакции, направленные на поиск специфических антител в сыворотке крови больных бактериальными инфекциями, используются для постановки ретроспективного диагноза, так как они становятся положительными к концу 1—2-й недели болезни. В дальнейшем их титр обычно нарастает, что является в диагностическом отношении очень важным показателем. Поэтому серологические реакции рекомендуется повторять с интервалом в 5—10 дней. Реакции считаются положительными в том случае, если титр их повышается при повторном исследовании в 4 раза и более. Однако при длительном заболевании (бруцеллез, туляремия, хроническая пневмония) динамика серологических реакций менее отчетлива, поэтому приходится ориентироваться на высоту титра антител. Диагностическую ценность имеют лишь определенные уровни антител. Например, для диагностики кишечных инфекций в РИГА значение имеет титр 1:320—1:640 и выше (сальмонеллезы, дизентерия). При этом необходимо учитывать эпидемическую обстановку в данной местности и принимать во внимание «нормальный» уровень антител у здорового населения. В РНГА, которая используется для поиска антител, при адсорбции на эритроцитах применяются не иммуноглобулины, а полисахаридные или белковые антигенные субстанции. Такие эритроцитарные диагностикумы называют антигенными. Помимо реакций агглютинации в диагностике бактериальных инфекций используют РСК, реакцию непрямого гемолиза, реакцию непрямой иммунофлуоресценции, непрямой иммуноферментный метод, реакцию нейтрализации и другие серологические методы.
Серологические реакции имеют лишь относительную достоверность, так как могут быть неспецифическими или положительными у лиц, перенесших соответствующую инфекцию в прошлом (анамнестическая реакция), а также у получивших профилактические прививки (прививочная реакция). Для более объективной оценки результатов серологических исследований используют дифференцированное исследование антител различной физико-химической природы. Антитела одной и той же иммунологической специфичности могут принадлежать к различным классам иммуноглобулинов и вследствие этого качественно отличаться по функциональной активности. Именно физико-химический тип антител определяет характер и интенсивность вызываемых ими таких иммунологических реакций, как лизис, агглютинация, нейтрализация антигенных и токсических свойств, в которых заключается биологический смысл реакции антиген — антитело. В настоящее время различают 5 основных классов иммуноглобулинов человека: Ig G, Ig M, Ig A, Ig D и Ig E. В реакциях гуморального иммунитета основная роль принадлежит первым 3 классам. При остром инфекционном заболевании на ранних стадиях иммунного ответа в сыворотке крови начинают определяться сначала макроглобулиновые Ig M с константой седиментации 19S, а затем в более поздние сроки появляются гамма-глобулиновые антитела класса G с константой седиментации 7S. В дальнейшем 78-антитела преобладают, а синтез 198-антител оказывается кратковременным. Обработка сывороток крови редуцирующими веществами (2-меркаптоэтанолом, цистеином и др.) приводит к избирательной инактивации Ig M, не оказывая влияния на Ig G. Титр антител, определяемый в сыворотке после обработки ее редуцирующим веществом, соответствует количеству 78-антител. Определение антител различной физико-химической природы помогает установить этап болезни, отличить инфекционное заболевание от анамнестических реакций, при которых в основном определяются 198-антитела, выявить хронических бактерионосителей брюшного тифа, когда нарушается синтез 198-антител и преобладают 78-антитела.
Перекрестные реакции, связанные с наличием общих антигенов среди различных бактерий, конечно, затрудняют правильное толкование результатов серологических исследований. Однако благодаря изучению динамики циркулирующих антител и определению иммуноглобулинов различных классов удается установить истинную природу заболевания. Серологические исследования помогают уточнить клинический диагноз, а при инфекциях, вызываемых условно-патогенными бактериями, подтвердить их роль в этиологии заболевания при положительных бактериологических находках, особенно в тех случаях, когда исследования проводятся на фоне антимикробной терапии. Серологические методы в лабораторной практике имеют вспомогательное значение и не могут заменить бактериологическое исследование. Комплекс микробиологических исследований позволяет конкретизировать синдромологический клинический диагноз и установить причину тех заболеваний, которые имеют полиэтиологическую природу. Необходимость таких исследований обусловлена их важной ролью в дифференциальной диагностике инфекционных болезней и выборе целенаправленной этиотропной терапии.
