Вирусологические методы исследования при инфекционных болезнях
Вирусологические исследования в клинике инфекционных болезней приобретают все большее значение, что в первую очередь обусловлено ростом удельного веса инфекций вирусной природы, клиника которых не всегда типична. В то же время быстрые и надежные методы вирусологической диагностики разработаны не для всех инфекционных болезней, многие из них трудоемки, для их проведения нужны специальные условия, экспериментальные животные, питательные среды и подготовленный персонал. В настоящее время для диагностики вирусных инфекций используют 3 основных вида исследования.
1. Микроскопическое исследование заразного материала с целью выявления вирусного антигена или патогномоничных изменений в тканях. В диагностических целях прямое микроскопическое исследование инфекционного материала от больных используется при ограниченном числе вирусных инфекций (бешенстве, ветряной оспе, желтой лихорадке, герпесе и др.). Более широкое применение получил метод, основанный на обнаружении вирусного антигена с помощью флуоресцирующих антител. Метод иммунофлуоресценции может быть достоверным лишь при четком выполнении всех технических требований.
2. Вирусологические методы.
3. Серологические исследования для определения прироста титра антител в динамике болезни. Серологические методы исследования более доступны в лабораторных условиях.
Для этих исследований необходимо взятие сыворотки крови в острый период болезни и в период реконвалесценции (парные сыворотки). Пробы крови для серологических исследований берутся стерильно без антикоагулянтов и консервантов.
Основными этапами вирусологических исследований являются выделение вирусов, их идентификация, характеристика основных биологических свойств. Для выделения различных групп вирусов в настоящее время не существует единой методики. Это в первую очередь обусловлено многообразием их свойств и особенностями культивирования вне организма хозяина. Для исследования используют биосубстраты (смывы со слизистых оболочек, кровь и ее компоненты, спинномозговая жидкость, моча и испражнения, биоптаты органов и тканей или их кусочки, взятые при аутопсии), которые подвергают специальной обработке с последующим пассированием материала. Взятый для исследования материал должен храниться при температуре от —20 °С до —70 °С. В зависимости от предварительного диагноза обработка материала имеет свои особенности, но во всех случаях предполагается получение субстрата, максимально очищенного от примесей слизи, клеток органов и тканей или их фрагментов, бактерий. Это достигается гомогенизацией исследуемого материала в специальном аппарате или растиранием в фарфоровой ступке на холоде с кварцевым стеклом (кусочки органов и тканей) с добавлением стерильного охлажденного (+4 С) 0,9 %
Видео: Самые страшные вирусы и болезни в истории человечества.
раствора хлорида натрия до получения 10—30 % суспензии и последующим центрифугированием при 1500—3000 об/мин в течение 10—15 мин. Полученную таким образом надосадочную жидкость используют для проведения дальнейших исследований.
До интенсивного развития и внедрения в широкую практику метода культуры тканей и клеток применялось заражение экспериментальных животных или эмбрионов курицы. Эти методы применяются и в настоящее время. Выявление вирусов с использованием животных наиболее целесообразно в тех случаях, когда удается воспроизвести в эксперименте типичную картину инфекционного заболевания или отдельные его проявления. Так, возбудители группы арбовирусов и Коксаки могут быть выявлены при заражении в мозг мышей-сосунков, гриппа — при заражении куриных эмбрионов или интраназальном введении исследуемого материала мышам. В вирусологических лабораториях в последние годы наиболее широко стали применять метод культуры клеток и тканей, позволяющий выделять аденовирусы, герпес-вирусы, респираторно-синцитиальный вирус, миксовирусы и другие и уже на первых этапах исследования осуществлять этиологическую диагностику заболевания. Основанием для этого являются хорошо изученные цитологические особенности взаимодействия большинства вирусов и клеток. Так, заражение клеток HeLa, Нер-2 материалом, содержащим аденовирус 2-го типа, уже на 3-й сутки приводит к изменению характера роста клеточного монослоя и к появлению типичных клеток в виде виноградных гроздьев и т. д., хорошо определяемых в обычном световом микроскопе при малом увеличении.
Исключительное значение для этиологической диагностики инфекционного заболевания имеет стандартизация выделения вируса из исследуемого материала, что на данном этапе работы предполагает использование генетически чистых линейных животных с учетом их фенотипических (в первую очередь возрастных) особенностей. Это обусловлено прежде всего тем, что экспериментальные животные различных генетических линий и возраста в разной степени восприимчивы к вирусам. Так, при интрацеребральном заражении мышей нейротропным штаммом WSN вируса гриппа у животных линий BALB/c, A, CBA и беспородных чувствительность оказалась наибольшей, такая же закономерность установлена и в случаях интраназального введения исследуемого материала. Существенное значение для конечных результатов работы по выделению вирусов имеет предварительное обследование животных, куриных эмбрионов, культур клеток и тканей на предмет латентного вирусоносительства. Весьма широко используемые в лабораторной практике куриные эмбрионы могут быть заражены вирусами лейкоза птиц, птичьего энцефаломиелита, инфекционного синусита, пситтакоза, болезни Ньюкасла, возбудителями некоторых бактериальных инфекций (паратифы и др.), а также микоплазмой. Еще большее число бактериальных и особенно вирусных агентов способно спонтанно заражать культуру клеток и тканей и переживать в них. Их присутствие существенно влияет на оценку исследуемого материала. Некоторые виды микоплазм в культуре клеток
могут обусловливать гемагглютинацию и гемадсорбцию и даже образовывать под агаровым покрытием бляшки, сходные с образуемыми вирусами. Немаловажное значение имеет также загрязнение клеточных культур одного типа другими, наиболее часто это бывает связано с клетками HeLa и наблюдается при работе с различными типами культур в одной комнате, при плохой обработке лабораторной посуды и др. Наличие контаминации клеточных культур или заражение животных бактериальными агентами, как правило, проявляется достаточно четко (изменение характера роста монослоя клеток, свойств культуральной среды, гибель куриных эмбрионов или животных с определенной симптоматикой и т. д.) и особых затруднений при оценке результатов не представляет. Сложнее обстоит вопрос с латентными формами инфекции, где требуется применение серологических и других методов. Эти указания должны учитываться в работе врача-вирусолога, особенно при проведении этиологической диагностики неясных случаев заболевания.
