Культивирование краснухи - краснуха
Видео: Вирусолог Г.П. Червонская про краснуху и дифтерию
Спектр чувствительных клеток. Вирусная этиология краснухи установлена Hiro и Tasaka в 1938 г. Чтобы выделить и идентифицировать вирус краснухи (1962) потребовалось 24 года. Поэтому удивительным оказалось то, что вирус краснухи может размножаться во многих системах первичных и перевиваемых клеток различного происхождения (С. А. Демидова и др., 1968- Parkman е. а., 1964а- Ingalls е. а., 1967- Sordoc, 1971).
Размножение вируса поддерживают многие виды первичных и перевиваемых культур человеческого, обезьяньего, кроличьего, бычьего, птичьего и другого происхождения. Однако только в весьма ограниченном количестве культур проявляется видимое цитопатическое действие (ЦПД) вируса краснухи. Даже в тех культурах, в которых ЦПД проявляется, оно часто зависит от техники культивирования, количества пассажей, пройденных вирусом, от штамма клеток, серий сред, сывороток и т. д. По этой причине для количественного определения вируса был разработан непрямой метод титрования с использованием феномена интерференции. Последний основан на свойстве культур, зараженных вирусом краснухи, приобретать резистентность к суперинфекции многими гетерологичными вирусами. Обычно для постановки реакции используют вирус, оказывающий выраженное цитопатическое действие в данной системе клеток. Чаще всего это вирусы ECHO 11, Коксаки В5 и вирус везикулярного стоматита. О наличии вируса краснухи в культуре судят по действию, препятствующему развитию ЦПД разрешающего вируса.
Из первичных культур клеток человеческого происхождения стабильные проявления ЦПД вируса наблюдали в культуре клеток амниона и щитовидной железы. Отчетливое ЦПД отмечено также в первичных культуpax, полученных из тканей эмбриона и взрослого кролика (Norrby, 1969).
Однако первичные культуры клеток не нашли широкого применения для идентификации и титрования вируса краснухи по ЦПД. Более удобным в этом отношении оказались перевиваемые клетки. Монослой таких культур клеток более однороден и ЦПД проявляется более постоянно и отчетливо. Среди клеток обезьяньего происхождения ЦПД вируса краснухи постоянно обнаруживали в перевиваемых линиях АН1, LLC-MK2 и особенно Vero. ЦПД вируса краснухи постоянно проявляется также в перевиваемых клетках почки кролика LLC-RK, RK13 и роговицы кролика SIRC (В. В. Чеботарев, 1971- Norrby, 1969). Широкое применение получили клетки RK13, которые чаще остальных используются для титрования вируса не только по ЦПД, но и методом бляшек (Р. Г. Десятскова, О. Г. Анджапаридзе, 1968). (рис. 1). В настоящее время наилучшим клеточным субстратом для получения высоких титров вируса, приготовления ГА- и КС-антигена, а также для титрования по ЦПД и методом бляшек являются перевиваемые клетки почки детеныша хомячка ВНК21 и особенно клон 13S этих клеток. С помощью этих клеток, особенно при использовании суспензионных культур, можно получить вирус в титрах до 10+8 ТЦД5о/Мл, тогда как в остальных культурах клеток титры вируса редко бывают выше 106 ТЦДбо/мл. А. И. Резепова и др. (1972) для культивирования и титрования вируса краснухи по ЦПД использовали диплоидные клетки легкого эмбриона человека. ЦПД в этой культуре клеток выявляется на 5—7-е сутки после заражения.
Взаимодействие вируса и клеток in vitro. Характерными особенностями, отмеченными при культивировании вируса краснухи in vitro, являются слабовыраженное цитопатическое действие, склонность к формированию хронической инфекции и выраженная резистентность зараженных культур к суперинфекции гетерологичными вирусами.
В большинстве культур клеток ЦПД вируса краснухи проявляется обычно в виде диффузного поражения монослоя. Для ЦПД вируса краснухи не характерна ни круглоклеточная дегенерация, ни формирование синцития. Обычно клетки теряют нормальные очертания, повышается их преломляемость. Часть клеток при этом отделяется от стекла. В некоторых случаях цитопатические изменения прогрессируют, приводя к уплотнению и сморщиванию ядра и последующему разрыву клетки. В некоторых линиях клеток наблюдали цитоплазматические включения базофильного или эозинофильного характера. ЦПД вируса краснухи, выявляемое в клетках RK13, отличается от такового в других культурах клеток. В этой клеточной системе наблюдается быстрый цитопатический эффект (в среднем через 40—50 ч), который выражается в возникновении очаговых поражений монослоя в виде так называемых микрофокусов (М. Б. Королев и др., 1973- McCarthy, 1969). В отличие от бляшек, наблюдаемых в других клеточных системах и представляющих очажки деструкции клеток, микрофокусы в клетках RK13 представляют собой пролиферативные клеточные массы, имеющие диаметр около 0,2 мм.
В культурах клеток, зараженных вирусом краснуЗсй, легко возникает хроническая инфекция (Norrby, 1969). ЦПД вируса краснухи никогда не распространяется на все клетки, и поэтому даже в культурах, где большая часть монослоя поражена, повторной смены среды бывает достаточно для возникновения хронической инфекции. Персистенция вируса наблюдается также в клетках при полном отсутствии видимого ЦПД. Хронической инфекции вируса краснухи подвержены как диплоидные, так и тетраплоидные клетки. Хронически инфицированные культуры клеток были получены также из тканей инфицированного краснухой плода и от детей с признаками врожденной краснухи (A. Boue, J. Воиё, 1969). Полученные культуры можно было поддерживать в состоянии хронической инфекции месяцами. При длительном культивировании хронически инфицированных вирусом краснухи клеток LLC-MK2 и диплоидных клеток человека не наблюдалось каких-либо морфологических изменений, однако в обоих случаях отмечен более медленный рост по сравнению с неинфицированными культурами. Plotkin и др. (1965а) в хронически инфицированных диплоидных клетках отмечали сокращение числа генераций. Добавление к хронически инфицированным культурам специфических антител и адамантадина (вещество, ингибирующее размножение вируса краснухи) не оказывало влияния на течение хронической инфекции. Очевидно, вирус тесно ассоциирован с клеткой и передается от одной генерации к другой.
Как правило, инфицированные вирусом краснухи культуры клеток и особенно хронически инфицированные проявляют резистентность к заражению другими вирусами. При этом спектр вирусов, по отношению к которым возникает резистентность, весьма широк (Parkman е. а., 1964а).
Механизм возникновения резистентности к суперинфекции гетерологичными вирусами, а также природа хронической инфекции пока неясны.
Известно, что вирус краснухи, размножаясь в плоде, приводит к формированию разнообразных аномалий развития. В связи с этим особый интерес представляет исследование характера размножения вируса в культурах клеток человеческого происхождения. Как уже говорилось, в культурах клеток, полученных из тканей пораженного краснухой плода, как правило, выявляется хроническая инфекция. Хроническую инфекцию можно также легко вызвать при заражении вирусом краснухи диплоидных клеток, полученных из различных органов нормального плода человека. Такие клетки могут длительно поддерживаться в лаборатории, однако продолжительность их жизни, как правило, короче, чем у неинфицированных культур. Отмечено также, что вирус краснухи при действии in vitro на диплоидные клетки, полученные из некоторых органов эмбриона, может привести к прекращению митозов (A. Воиё, J. Воиё, 1969). При этом в «молодых» культурах размножение клеток прекращалось в течение 4—8 пассажей, тогда как «старые» прекращали размножаться уже в течение 1—2 пассажей после заражения. Далее Plotkin и Vaheri (1967) обнаружили, что в культурах диплоидных клеток WI-38, инфицированных вирусом краснухи, образуется специфический белок. Будучи экстрагирован из инфицированных культур, он оказывал ингибирующее действие на митотическую активность нормальных диплоидных клеток и был назван авторами «ингибином». «Ингибин» проявлял термолабильность и не терял активности после обработки специфическими противовирусными антителами.
Цитогенетическое изучение показало, что в зараженных культурах диплоидных клеток процент аберраций хромосом выше, чем в незараженных. Так, по данным (A. Boue, J. Воиё, 1969), в хронически инфицированных диплоидных культурах процент аберрантных клеток составлял в среднем 20—25, тогда как в нормальных — около 10. Исследования, проведенные в нашей лаборатории Л. В. Пряничниковой (1971) с использованием штамма диплоидных клеток L-58 и различных штаммов вируса краснухи, показали, что количество аберрантных клеток в хронически инфицированных культурах примерно в 3 раза выше, чем в нормальных.
Существует, однако, мнение, что хромосомные аберрации не являются результатом прямого действия вируса на хромосомы, а скорее зависят от общего дегенеративного процесса.
Кинетика размножения и морфогенез. При изучении кинетики размножения вируса краснухи в культуре перевиваемых клеток ВНК.21 (Vaheri е. а., 1967) было показано, что эклипс-фаза составляла около 12 ч. На протяжении ранней стадии инфекции большая часть инфекционного вируса была связана с клеткой. В более поздних стадиях соотношение внеклеточного и внутриклеточного вируса изменялось в пользу первого. Титры вируса в среде достигали пика к 48—72 ч.
При электронномикроскопическом изучении инфицированных культур (М. Б. Королев и др., 1973- Holmes е. а., 1969) было обнаружено, что внеклеточный вирус начинает появляться &lsquo-вокруг отдельных клеток примерно через сутки после заражения. Вирусные частицы высвобождались из клетки исключительно посредством почкования и приобретали внешнюю оболочку, проходя через цитоплазматическую мембрану.
Формирование вирионов краснухи осуществлялось по-разному: оно происходило на поверхности клетки, в вакуолях комплекса Гольджи и иногда непосредственно в цитоплазматическом матриксе. Причины преобладания того или иного способа формирования неясны. Регулярное выявление вирионов обычно начиналось со 2-х суток после заражения. В последующие сроки количество вакуолей в клетке сильно увеличивалось. Формирование вирионов всегда осуществлялось почкованием, в процессе которого нуклеоид обволакивался мембраной вакуоли или цитоплазмы. Нуклеоиды были тесно связаны с мембраной клетки или вакуоли и никогда не наблюдались в виде скоплений в цитоплазме. Holmes и др. (1969) в поздние стадии инфекции наблюдали также аберрантные формы, представляющие собой крупные частицы, содержащие два или три нуклеоида.
Таким образом, процесс формирования вирионов краснухи протекает исключительно в цитоплазме чувствительной клетки, что подчеркивает сходство вируса краснухи с арбовирусами группы А.
