Лабораторная техника - краснуха
Видео: лабораторная посуда
Получение антисывороток. Техника получения антисывороток к вирусным антигенам подробно описана Habel и Salzman (1972). Наиболее удобным животным для получения иммунной сыворотки против вируса краснухи, как и против большинства вирусов, является кролик. Самая распространенная схема иммунизации— троекратное введение в ушную вену по 5 мл вируссодержащей жидкости с интервалами 2—3 нед. Кроликов обескровливают через неделю после последнего введения. Культуральная жидкость, применяемая для иммунизации, не должна содержать большое количество белка. Для приготовления такой жидкости монослой зараженных клеток тщательно отмывают от предшествующей среды и затем вносят поддерживающую среду, не содержащую сыворотки, которая и используется для иммунизации.
В нашей лаборатории для получения больших количеств сыворотки успешно использовали овец (Р. Г. Десятскова, Э. Ф. Опочинский, 1973). Иммунизацию проводили троекратно, используя штамм вируса краснухи Sp-2. При первой и второй иммунизации вирус вводили одновременно в вену и внутримышечно в дозе 3,3— 8,1Х108 БОЕ, а при третьей — только внутривенно в дозе 4,2Х108 БОЕ. Интервалы между первым и вторым введением вируса составляли 3 нед, а между вторым и третьим — 1 нед. Животное обескровливали через 7 дней после последнего введения. Титры антигенагглютининов в сыворотке составляли 512—1024.
Выделение и идентификация вируса краснухи. В практической деятельности вирусолог может столкнуться с необходимостью выделения вируса из носоглотки или крови больного краснухой. В нашей лаборатории использовали технику выделения и последующей идентификации вируса краснухи, отработанную Р. Г. Десятсковой.
Тампоны с носоглоточным отделяемым помещали в стерильные пробирки с 3 мл раствора Хэнкса, содержащего 0,5% желатины, 1000 ЕД/мл пенициллина, 500 ЕД/мл стрептомицина и 20 ЕД/мл нистатина. Манипуляцию взятия слизи из носоглотки следует проводить энергично- желательно также взятие слизи из носа, для чего в каждую ноздрю вставляют на несколько минут ватный тампон. Кровь брали из пальца или из вены в пробирки с сухим гепарином. Пробы доставляли в лабораторию во льду и в случае необходимости до исследования хранили при температуре —40°.
Посев испытуемых проб производили на пробирочную культуру клеток RK13. Посевная доза клеток на каждую пробирку составляла 120 000—150 000 клеток в 1 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота. Инокуляцию осуществляли после формирования монослоя, обычно через 3—4 дня. В каждую пробирку вносили по 0,5 мл материала из носоглотки и по 0,1 мл крови. На каждую пробу брали 3—4 пробирки. После часа контакта при комнатной температуре в пробирки добавляли по 1 мл среды 199 с 6% гретой обработанной каолином сыворотки крупного рогатого скота и инкубировали при температуре 35°. Для адаптации и накопления вируса инокулированные культуры подвергали 3—4 слепым пассажем через каждые 8— 10 дней.
Индикацию и идентификацию вируса краснухи проводили по интерференции с вирусом везикулярного стоматита (ВВС) в той же культуре клеток. Разрешающий вирус ВВС в дозе 100—320 ТЦД50 вносили через 7—9 дней после заражения испытуемым агентом. Результаты реакции учитывали через 48—96 ч, когда в контрольных пробирках разрешающий вирус вызывал четкую дегенерацию. В культурах, проявляющих резистентность к действию ВВС, можно было предполагать наличие интерферирующего вирусного агента. .
Для идентификации выделенных вирусных штаммов использовали гипериммунную сыворотку овцы, иммунизированной вирусом краснухи (см. выше). Можно пользоваться также антисывороткой любого происхождения. Сыворотку в разведении 1 : 8 смешивали с равным объемом испытуемого вируса в разведении 1 : 10 и выдерживали 2 ч при комнатной температуре. Средой разведения служил 0,5% раствор лактальбумина в растворе Эрла. В каждую пробирку с культурой клеток RK13 вносили по 0,2 мл смеси сыворотки и вируса и инкубировали в течение часа при комнатной температуре (культуральную жидкость перед этим удаляли). Затем в пробирки добавляли среду 199 с 2% обработанной каолином сыворотки крупного рогатого скота и инкубировали культуру при температуре 35°. После 7 дней инкубации культуральную жидкость удаляли и в пробирки вносили по мл разрешающего вируса в дозе 100—320 ТЦД50, разведенного той же средой. Реакцию учитывали после появления дегенерации в контрольной культуре клеток. Наличие цитопатического действия в опытной культуре свидетельствовало о нейтрализации вируса специфической сывороткой. Одновременно испытывали сыворотку на токсичность и проводили контроль рабочей дозы разрешающего вируса.
В нашей лаборатории был успешно применен «классический» способ индикации и идентификации вируса краснухи с использованием первичной культуры почки зеленой мартышки и в качестве разрешающего вируса ECHO и (Parkman е. a., 1964b), однако, на наш взгляд, этот способ мало пригоден для обычной вирусологической практики.
Методы идентификации, основанные на наблюдении непосредственного цитопатического действия вируса краснухи, редко используются для выявления циркулирующих штаммов вируса, так как «дикие» штаммы без предварительной адаптации обычно не оказывают цитопатического эффекта на культуру. Проявления ЦПД вируса краснухи вообще довольно капризны и часто зависят от штаммов клеток, серий сред, сывороток и т. д., что дало нам основание рекомендовать для выделения вируса непрямой метод.
Титрование вируса. Вирус краснухи титруют как непрямым методом, основанным на интерференции, так и прямым, в основе которого лежит непосредственно наблюдаемое цитопатическое действие. При непрямом методе титрования можно пользоваться методикой, приведенной выше при описании индикации вируса. Нужно только включить этап приготовления десятикратных разведений вируса. В качестве поддерживающей среды после инокуляции культур клеток различными разведениями вируса употребляется среда 199 с 2% обработанной каолином сыворотки крупного рогатого скота. За титр принимают наибольшее разведение, которое предохраняет 50% зараженных культур от дегенерации, вызываемой разрешающим вирусом. Титры вируса выражают в InDso/мл (интерферирующие дозы).
Для титрования вируса прямым методом используют культуры клеток, подверженные ЦПД вируса краснухи. Чаще всего это RK13 (Hopps е. а., 1969), реже—SIRK и ВНК21. Обычно в пробирку с культурой вносят по 0,2 мл соответствующего десятикратного разведения вируса и после контакта в течение часа при комнатной температуре добавляют поддерживающую среду. За титр принимают наибольшее разведение вируса, оказывающее цитопатическое действие на 50% инокулированных культур (ТЦД50).
В исследовательских лабораториях для титрования вируса краснухи широко пользуются методом бляшек. Чаще всего для этих целей используют клетки RK13. Для практических лабораторий этот метод несколько сложен, поэтому мы не приводим его подробного описания, а ограничиваемся соответствующими ссылками (Р. Г. Десятскова, О. Г. Анджапаридзе, 1968- Hopps е. а., 1969).
Серологические исследования. Выделение вируса краснухи — весьма трудоемкая процедура и вряд ли может найти широкое распространение. Для практических целей гораздо большую ценность представляют серологические реакции. С их помощью можно в течение нескольких дней подтвердить диагноз краснухи, исследовать состояние иммунитета той Или иной группы населения, установить эффективность вакцинации и т. д. Антитела к вирусу краснухи выявляются в реакциях нейтрализации (PH), торможения гемагглютинации (РТГА), связывания комплемента (РСК) и иммунофлуоресценции (РИФ). На практике наибольшее распространение получила РТГА в силу ее простоты, специфичности и быстроты получения результатов. Приводим подробное описание этой реакции.
Реакция торможения гемагглютинации. РТГА вируса краснухи впервые описали Stewart и др. в 1967 г. Авторы нашли способ удаления из сывороток термостабильных ингибиторов гемагглютинации вируса краснухи, представляющие собой |3-липопротеины. С этой целью сыворотки, используемые в реакции, обрабатывают 25% суспензией каолина. В нашей лаборатории в основном применяют несколько модифицированную методику этих авторов. Исследовав более 10 000 сывороток, мы можем рекомендовать этот метод как достаточно точный и наиболее доступный для вирусологических лабораторий нашей страны.
В качестве растворителя используют декстрозо-желатино-вероналовый буферный раствор (ДЖВ).
Каолин. 25% суспензию каолина готовят по методу Clarke и Casals (1958) путем четырехкратного отмывания в фосфатном буферном растворе pH 7,2. Навеску каолина 250 г смешивают с 750 мл буферного раствора, энергично встряхивают и дают отстояться. После замены надосадочной жидкости свежим раствором процедуру повторяют. Окончательную суспензию автоклавируют в течение 30 мин при 115 атм. и затем хранят при температуре 4°. Перед употреблением фосфатный буферный раствор заменяют равным количеством ДЖВ.
Эритроциты. Мы отдаем предпочтение эритроцитам взрослых голубей, хотя пользуемся также эритроцитами однодневных цыплят. У цыплят берут кровь путем декапитации, а у голубей-доноров — из сердца. При этом одномоментно у голубя берут 5 мл крови в шприц с 5 мл раствора Альсевера. Кровь до использования (обычно в течение недели) хранят в растворе Альсевера в соотношении 1 : 10, 1 : 20. Перед использованием эритроциты фильтруют и трижды отмывают в десятикратном количестве ДЖВ путем последовательного центрифугирования в течение 10 мин при 1200 об/мин. Из осадка готовят 0,25% суспензию эритроцитов для реакции и 50% суспензию для обработки сывороток.
Обработка сывороток. Исследуемые сыворотки для удаления неспецифических ингибиторов и предотвращения спонтанной агглютинации прогревают при температуре 56° в течение 30 мин и обрабатывают каолином и эритроцитами. К 0,1 мл прогретой сыворотки добавляют 0,3 мл 25% суспензии каолина и выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 20 мин, несколько раз энергично встряхивая. После этого смесь центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин и, не отсасывая надосадочную жидкость, добавляют 0,05 мл 50 % суспензии эритроцитов. После часа контакта при 4°, в течение которого эритроциты необходимо 2—3 раза слегка взбалтывать, смесь вновь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Процедуру центрифугирования можно заменить инкубацией при 4° в течение ночи. Надосадочная жидкость представляет собой сыворотку в разведении 1 : 4.
Постановка РТГА. Реакцию проводят в макро- и микромодификации. При постановке реакции макрометодом пользуются пластмассовыми панелями с емкостью лунок 1,5 мл. Микрометодику осуществляют с помощью микротитратора Такачи фирмы «Метримпекс» (Венгрия). При титровании антигена, приготовлении рабочей суспензии эритроцитов и разведений испытуемых сывороток используют ДЖВ, содержащий 0,2% альбумина крупного рогатого скота, добавляемого для стабилизации реакции. При отсутствии альбумина крупного рогатого скота можно пользоваться человеческим плазменным альбумином, получаемым из отходов глобулинового производства, или раствором плазменного альбумина для внутривенного введения (Р. Г. Десятскова и др., 1971).
Поскольку макро- и микрореакции проводят идентичным образом, приводим описание макрореакции, а объем ингредиентов, вносимых при микрореакции, помещаем в круглых скобках. При титровании антигена для определения рабочей дозы двукратные разведения делают в объеме 0,4 (0,05) мл- 0,25% суспензию эритроцитов вносят в объеме 0,2 (0,025) мл. Все ингредиенты охлаж-
Дают до 0 гр. в ледяной бане. Результаты учитывают через 1,5—2 ч инкубации при температуре 4°. При разведении антигена в микрореакции лучше пользоваться микропипеткой. За титр антигена принимают наибольшее разведение, вызывающее отчетливую агглютинацию. Рабочая доза антигена при постановке РТГА содержит 4 единицы.
Двукратные разведения испытуемых сывороток выполняют в объеме 0,2 (0,025) мл. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,2 (0,025) мл рабочего разведения антигена, выдерживают смесь в течение часа при комнатной температуре и затем добавляют 0,2 (0,025) мл 0,25% суспензии эритроцитов, охлажденной во льду. Реакцию учитывают через 2—3 ч инкубации при температуре 4°.
При постановке реакции микрометодом контакт сыворотки и антигена лучше проводить при температуре 4° в течение 2 ч, так как результаты реакции, проводимой этим методом, в большей степени зависят от соблюдения режима охлаждения.
Титром сыворотки считают наибольшее разведение, полностью подавляющее гемагглютинацию. Сыворотку считают негативной в том случае, когда подавления агглютинации не наблюдают в разведении 1 : 8.
Каждую серию титрований сопровождают соответствующими контролями: титрованием иммунной сыворотки с известным титром антител, негативной сыворотки, контролем сыворотки и эритроцитов на наличие спонтанной агглютинации. При проведении двух последних контролей отсутствие соответствующих компонентов компенсируют соответствующим объемом ДЖВ. Желательно использовать бидистиллированную воду.
В настоящее время не существует стандартной методики постановки РТГА вируса краснухи, которая нивелировала бы результаты, получаемые в разных лабораториях. Известно несколько модификаций этой реакции, суть которых заключается в основном в использовании разных способов обработки сывороток для удаления неспецифических ингибиторов, а также в применении различных буферных растворов и эритроцитов.
Помимо удаления ингибиторов с помощью адсорбции на каолине, широко применяется преципитация сывороток смесью гепарина и хлористого марганца (Cooper е. а., 1969а), а в последнее время находит применение обработка сывороток смесью сернокислого декстрана и хлористого кальция (DS-C) (Haukenes, Aasen, 1971).
В качестве буферных растворов, кроме ДЖВ, используют боратный буферный раствор с 0,4% альбумина (BABS)- этот же раствор в смеси с фосфатным буферным раствором (BABS+PBS) (Halonen е. а., 1967), а в последнее время также HEPES буфер или HEPES с альбумином и желатином (HSAG) (Schmidt е. а., 1971).
Заслуживают внимание некоторые вновь предложенные модификации РТГА. Так, Gupta и Peterson (1971) разработали методику применения формалинизированных эритроцитов с использованием новой буферной системы- Schmidt и Dennis (1972) использовали человеческие эритроциты группы 0, обладающие рядом преимуществ при практическом применении- Quinn и др. (1972) предложили обработку человеческих эритроцитов трипсином, что повышает их чувствительность и открывает новые возможности для стандартизации реакции.
Все более широкое применение получает тест на наличие в сыворотке макроглобулинов (IgM, антитела 19S). С помощью этого теста можно подтвердить диагноз краснухи в течение одного дня, так как наличие в сыворотке специфических IgM является показателем текущего инфекционного процесса. Наиболее простым методом определения IgM, хотя и наименее точным, является обработка сывороток 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (Р. Г. Десятскова, Э. Ф. Опочинский, 1973- Banatvala е. а., 1967).
Сыворотку обрабатывают 2-МЭ (конечная концентрация 2-МЭ — ОДМ) в течение одного часа при 37° и затем испытывают в РТГА, проводимой по обычной методике. Параллельно титруют ту же сыворотку, но не обработанную 2-МЭ. 2-МЭ разрушает IgM и поэтому по разнице в титрах антител, определяемых в сыворотках, взятых до и после обработки 2-МЭ, можно судить
о наличии IgM. Достоверной считается не менее чем четырехкратная разница в титрах.
Более совершенными методами выявления макроглобулинов являются центрифугирование в градиенте сахарозы (Field, Murphy, 1972), фильтрация в геле (Burgin-Wolff е. а., 1971) и непрямая иммунофлуоресценция (Haire, Hadden, 1972), однако эти методы мало применимы в широкой практике из-за их технической сложности. По этой же причине мы не приводим подробного описания, а ограничиваемся лишь ссылками в отношении выявления антител посредством реакции нейтрализации (Parkman е. а., 1964- Furesz е. а., 1969- Kobayashi е. а., 1973), связывания комплемента (Sever е. а., 1965) и методом иммунофлуоресценции (Brown е. а., 1964).
В настоящее время отчетливо ощущается необходимость в разработке стандартной методики постановки серологических реакций (по крайней мере РТГА) и в выпуске стандартных ингредиентов для их постановки, что повысило бы точность получаемых результатов и значительно упростило бы проведение массовых серологических обследований.
