Реакция связывания комплемента - микробиология с техникой микробиологических исследований
Реакция связывания комплемента (РСК)
Соединение антитела с антигеном и комплементом не обязательно сопровождается разрушением антигена. Это. в большей степени относится к микробам, которые проявляют устойчивость к литическому действию комплемента. Происходящее в таких случаях связывание комплемента может быть выявлено непрямым путем с помощью метода, открытого Ж. Борде и С. Жангу. Сущность метода заключается в следующем. При взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном происходит соединение антигена с антителом, образуется комплекс антитела с антигеном, который связывает комплемент. В случае несоответствия антигена и антитела связывания комплемента не происходит, т. е. комплемент остается свободным. Процесс связывания комплемента при положительной реакции антитела с антигеном остается невидимым. Поэтому для определения, связался ли комплемент или остался свободным, в качестве индикатора в реакцию вводится гемолитическая система (гемолитическая сыворотка — гемолизины и эритроциты барана). Реакция связывания комплемента ставится в две фазы: в первой фазе к исследуемой сыворотке (антителу) добавляется антиген и комплемент, во второй — добавляется гемолитическая система.
Если в первой фазе реакции исследуемая сыворотка содержит специфические для антигена антитела, то комплемент будет связан с комплексом антиген+антитело, при добавлении гемолитической системы гемолиз не произойдет и реакция будет считаться положительной .
Если же исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, т. е. антиген и антитела не соответствуют друг другу, тогда комплемент в первой фазе реакции остается свободным и при добавлении гемолитической системы произойдет гемолиз (растворение) эритроцитов, т. е. реакция будет отрицательной (см. рис. 57).
Реакция Борде—Жангу (реакция связывания комплемента), обладающая высокой чувствительностью, приобрела большое диагностическое значение. Это значение еще больше увеличилось, когда Жангу показал, что реакция может происходить не только с бактериальными телами, но и с их экстрактами. Реакция Борде—Жангу применяется при диагностике сапа, гонореи и других заболеваний. А. Вассерман, исходя из идеи Ж. Борде, применил реакцию связывания комплемента для серодиагностики, сифилиса. Эта реакция получила практическое применение в распознавании сифилиса.
Реакция связывания комплемента применяется с двоякой целью:
- Для обнаружения в сыворотке специфических антител с помощью известного антигена. Например, имея антиген, приготовленный из культуры гонококка, можно обнаружить гонококковые антитела в сыворотке больного. В этом случае необходимо пользоваться антигеном, доза которого, связывающая комплемент, заранее вытитрована на значительном количестве сывороток больных.
- Для определения вида антигена при помощи сыворотки, содержащей антитела к определенному антигену. Например, при помощи соответствующей иммунной сыворотки можно идентифицировать палочку коклюша. В этих случаях необходимо иметь сильную иммунную сыворотку, титр которой известен.
Ингредиенты (составные части) реакции. Для реакции связывания комплеме-нта необходимы следующие ингредиенты: 1) эритроциты барана, 2) гемолитическая сыворотка, 3) комплемент, 4) антиген и 5) испытуемая сыворотка.
1. Эритроциты получают из дефибрин ированной крови барана. Для этого у барана берут кровь из яремной вены непосредственно в банку со стеклянными бусами. Встряхивают в течение 10 минут. Процеживают через стерильную марлю, центрифугируют и сыворотку отсасывают. Три раза отмывают эритроциты от остатка сыворотки физиологическим раствором хлористого натрия центрифугированием в течение 10—15 минут. После третьего центрифугирования из осадка приготовляют 3% взвесь эритроцитов для опыта. При хранении в леднике дефибринированная кровь может употребляться в течение 6—8 дней.
Схема приготовления разведений гемолитической сыворотки из основного разведения 1 : 100
Пробирка | Основные разведенияв мл | Физиологическийраствор в мл | Полученноеразведение |
1-я | 0,1 | 0,9 | 1:1 000 |
2-я | 0,1 | 1,1 | 1:1 200 |
3-я | 0,1 | 1,4 | 1:1 500 |
4-я | 0,1 | 1,7 | 1:1 800 |
5-я | 0,1 | 1,9 | 1:2 000 |
6-я | 0,1 | 2,4 | 1:2 500 |
7-я | 0,1 | 2,9 | 1:3 000 |
8-я | 0,1 | 3,4 | 1:3 500 |
- Гемолитическая сыворотка обычно получается от кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. Гемолитическую сыворотку выпускают в сухом виде институты бактерийных препаратов. На этикетке ампулы указан титр сыворотки и срок годности.
Таблица 4
Схема титрования гемолитической сыворотки
Титром гемолитической сыворотки называется ее предельное разведение, способное в объеме 0,5 мл растворить 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов в присутствии 0,5 мл комплемента в течение часа при температуре 37°.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме: приготовляют основное разведение выворотки 1 : 100 (0,1 мл сыворотки+0,9 мл физиологического раствора), из которого готовят дальнейшие разведения (табл. 3).
В ряд пробирок последовательно отмеривают по 0,5 мл полученных разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1 : 1000, добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл комплемента, разведенного 1 :10, и по 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов. Титрование гемолитической сыворотки проводится по схеме (табл. 4).
Из схемы видно, что данная сыворотка еще в разведении 1 : 1500 дает полный гемолиз (т. е. титр сыворотки 1 : 1500). В дальнейшем для опыта берут в 3 раза меньшее разведение (тройной титр). Так, например, если титр гемолитической сыворотки 1 : 1500, применяется разведение 1:500 (т. е. 0,1 мл сыворотки 49,9 мл физиологического раствора).
- Комплемент. В качестве комплемента в реакции служит сыворотка морских свинок (их комплемент обладает наибольшей активностью) или сухой комплемент, выпускаемый институтами бактерийных препаратов.
Так как степень активности комплемента не у всех морских свинок одинакова, необходимо брать кровь у нескольких животных и полученные сыворотки смешивать.
Титром комплемента обозначается первая минимальная доза комплемента, растворяющая эритроциты. Если, например, в приведенной схеме титрования полный гемолиз произошел в пробирке, содержащей 0,3 мл комплемента, и неполный гемолиз оказался в пробирке, содержащей 0,25 мл комплемента, то титром комплемента надо считать 0,3 мл в разведении 1: 10. В качестве рабочей дозы комплемента обычно берется титр его, увеличенный на 20—25%, т. е. приблизительно это соответствует тому количеству комплемента, которое содержится в предпоследней пробирке с гемолизом.
Как при титровании гемолитической сыворотки, так и при титровании комплемента ставятся два контроля (см. табл. 5).
Схема титрования комплемента без антигена
Таблица 6
Схема титрования комплемента в присутствии антигена
Кроме того, рекомендуется титровать комплемент также в присутствии антигена.
Титрование комплемента в присутствии антигена необходимо в тех случаях, когда антиген подавляет титр комплемента (антикомплементарное свойство антигена). Это свойство может зависеть как от природы самого антигена, так и от способа его приготовления.
- Антиген. В реакции связывания комплемента используются различные антигены. Антигенами являются культуры разнообразных микробов или экстракты патологически измененных или нормальных тканей. В качестве бактериального антигена могут употребляться как взвеси микробов в физиологическом растворе, так и экстракты из микробов, приготовленные различными способами (например, антиформиновый гонококковый антиген, спиртовой туберкулезный и т. п.). Хорошими антигенными свойствами обладает микробная взвесь, предварительно убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для реакции исходную взвесь антигена разводят по оптическому стандарту, содержащему. 1 млрд. микробных тел в 1 мл, и берут в объеме 0,5 мл.
В качестве антигена применяют также микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате (аппарат для встряхивания) или путем обработки антиформином.
Для реакции следует употреблять такую дозу антигена, которая вызывает полную задержку гемолиза с сыворотками, содержащими соответствующие гемолизины, но которая сама по себе задержки гемолиза не дает. В силу того, что все микробные антигены адсорбируют какое-то количество комплемента, перед титрованием их проверяют на антикомплементарные свойства, определяя растворяющую дозу комплемента, т. е. то наибольшее количество антигена, которое не вызывает задержки гемолиза. Определение такой растворяющей дозы антигена производится по схеме (табл. 7).
Из таблицы видно, что в данном примере растворяющая доза антигена составляет 0,4 мл. Для опыта берут половину такой дозы, т. е. ориентировочная доза будет равна 0,2 мл.
- Испытуемая сыворотка. Сыворотку больного отделяют от сгустка через 3—48 часов после взятия крови и инактивируют в водяной бане при 56° в течение 30 минут.
Таблица 7 Схема определения растворяющей дозы антигена
Пробирка | Антигенв мл | Физиологическийраствор в мл | Рабочаядоза комплемента в мл | Гемолитическаясистема в мл | Результат |
1 -Я | 0,1 | 0,9 | 0,5 | 1,0 | Гемолиз |
2-Я | 0,2 | 0,8 | 0,5 | 1,0 | 1Стояние в термостате при 37° втечение часа |
3-Я | 0,3 | 0,7 | 0,5 | 1,0 | |
4-я | 0,4 | 0,6 | 0,5 | 1,0 | » |
5-я | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | ^ Задержка гемолиза |
Инактивированные сыворотки могут сохраняться в холодильнике в течение 5—6 дней. Для реакции сыворотка больного применяется в разведении 1:5 (0,1 мл сыворотки+0,4 мл физиологического раствора).
Постановка опыта реакции связывания комплемента (табл. 8).
Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующие ингредиенты:
- физиологический раствор (0,85%);
- сыворотка, подлежащая исследованию, инактивированная при 56° в течение 30 минут в водяной бане;
- антиген (взвесь бактерий или экстракт из них), не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни задержки его в дозе, установленной титрованием;
- комплемент в рабочей дозе, установленной титрованием;
- гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
- 3% взвесь бараньих эритроцитов.
Каждый из ингредиентов, который применяется для реакции, берется в количестве 0,5 мл. Если доза отдельного компонента меньше этого объема, то ее дополняют физиологическим раствором до 0,5 мл.
Основной опыт связывания комплемента желательно ставить сразу с двумя — тремя антигенами, приготовленными различным способом (А1, А2, А3 в табл. 8).
Схема основного опыта
Для контроля необходимо одновременно ставить реакцию точно в тех же условиях с нормальной сывороткой и сывороткой, заведомо дающей положительный результат. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент. Смесь выдерживают при 37° в течение часа. По истечении указанного срока в пробирку добавляют смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов — гемолитическую систему. Гемолитическую систему добавляют или непосредственно после приготовления смеси из равных объемов гемолитической сыворотки и эритроцитов, или после получасового выдерживания этой смеси в термостате. Смесь всех ингредиентов после энергичного встряхивания помещают в термостат при 37° на 1 час, а затем на 12 часов переносят в холодильник или оставляют при комнатной температуре.
В пробирках, в которых произошел гемолиз, жидкость становится прозрачной, но окрашенной (см. рис. 58).
Рис. 58. Схема реакции связывания комплемента.
а — реакция положительная- б — реакция отрицательная.
(++ + + )—полная задержка гемолиза- жидкость не окрашена, значительный осадок эритроцитов-
(+ + + ) —ясная задержка гемолиза- жидкость окрашена, осадок эритроцитов-
(++)—частичная задержка гемолиза- жидкость окрашена интенсивно- компактный осадок эритроцитов-
( + )—очень слабая задержка гемолиза- жидкость окрашена интенсивно, осадок небольшой-
(±) —следы задержки гемолиза, при взбалтывании заметен незначительный осадок-
(—)—полный гемолиз (отрицательная реакция).
