Стафилококки - микробиология с техникой микробиологических исследований
ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
ПАТОГЕННЫЕ КОККИ
К патогенным коккам, вызывающим разнообразные по своим клиническим проявлениям заболевания у человека, относятся: 1) стафилококки, 2) стрептококки, 3) пневмококки, 4) менингококки и 5) гонококки.
По тинкториальному признаку (окрашиваемости) их можно разделить на две подгруппы: грамположительные кокки (стафилококки, стрептококки и пневмококки), грамотрицательные кокки (менингококки и гонококки).
Характерной особенностью всех патогенных кокков является способность вызывать гнойные воспалительные процессы, почему их называют также пиогенными (гноеродными) кокками.
Наиболее резко и постоянно гноеродные свойства выражены у стафилококков.
СТАФИЛОКОККИ
Морфология и тинкториальные свойства. Стафилококки— Staphylococcus (впервые выделены Пастером в 1880 г.) имеют форму правильных шаров со средним диаметром 0,8—0,9 мк. В мазке из чистой культуры стафилококки располагаются в виде кучек и скоплений, напоминая гроздь винограда (рис. 60). В гною и другом патологическом материале нередко можно встретить единичных кокков, парных и даже короткие цепочки. Они хорошо красятся основными анилиновыми красками, грамположительны, спор, капсул не образуют, неподвижны.
Культуральные и биохимические свойства. Стафилококки хорошо растут на обычных питательных средах как в присутствии, так и в отсутствии свободного кислорода. Температурный оптимум 37°.
Рис. 60. Стафилококк (а) и стрептококк (б) в чистой культуре.
Рис. 61. Колонии стафилококка на мясопептонном агаре. Ув. 20.
Рис. 62. Посев уколом в желатину.
Отдельные колонии на поверхности агара представляют собой округлые диски средней величины, выпуклые, влажные, непрозрачные, гомогенной или мелкозернистой структуры (см. рис. 01). Цвет колоний зависит от пигмента, который вырабатывают стафилококки и может быть золотистым (Staphylococcus aureus), лимонно-желтым (Staphylococcus citreus) и белым (Staphylococcus albus). При посеве штрихом на скошенный агар образуется обильный рост стафилококка, пигментированный.
Пигменты стафилококка относятся к липохромам, нерастворимы в воде и окрашивают только культуру, но не питательную среду. Образование пигмента идет интенсивно, когда микроорганизмы выращиваются в присутствии кислорода, при комнатной температуре, на свету.
При посеве уколом в желатину на 2—3-й день роста на поверхности среды заметна зона разжижения. По мере разжижения культура падает на дно в виде хлопчатого осадка (рис. 62).
На бульоне стафилококки дают обильный рост. Через 24 часа пребывания в термостате бульон мутнеет, и на дне пробирки образуется осадок.
Стафилококки быстро створаживают молоко, сообщая ему кислую реакцию.
Ферментируют (без газа) лактозу, глюкозу, мальтозу, маннит. Способность расщеплять маннит обычно характеризует патогенные штаммы стафилококка.
Патогенные стафилококки на чашках с кровяным агаром образуют колонии, окруженные зоной гемолиза, и свертывают плазму цитратной крови.
Резистентность. Стафилококк относится к числу весьма стойких микробов. Температура 80° убивает его во влажном состоянии в течение 10 минут. Температуру 70° стафилококки выдерживают до 1 часа. Карболовая кислота (3—5% раствор) убивает их в течение 15— 30 минут. В гною стафилококк сохраняется длительное время.
Токсины, ферменты стафилококков, патогенность их для животных. Патогенные стафилококки продуцируют ряд токсинов и ферментов. Стафилококковый гемолихин растворяет эритроциты. Этот токсин термолабилен (разрушается при 55°), относится к экзотоксинам и при иммунизации им животных можно получить антитоксин. Фильтрат культур стафилококка обладает также некротическим и летальным действием. В настоящее время доказано, что гемолизин, некротоксин и летальный токсин являются составными частями единого стафилококкового экзотоксина. Эти токсины неотделимы друг от друга, и обнаружение одного из них служит доказательством патогенности выделенного стафилококка. Некоторые из гемолитических штаммов золотистого стафилококка вырабатывают энтеротоксин, вызывающий явления острого гастроэнтерита. В фильтратах культур стафилококка часто обнаруживается лейкоцидин — яд, разрушающий лейкоциты. Из ферментов патогенные стафилококки выделяют: 1) плазмокоагул а з у — свертывающую плазму, 2) фибринолизин — растворяющий сгустки фибрина, 3) гиалуронидазу — растворяющую гиалуроновую кислоту, вещество склеивающее элементы соединительной ткани, 4) пенициллиназу — инактивирующую пенициллин и 5) лецитиназу — образует зону помутнения вокруг колоний на желточно-солевом агаре (среда Чистовича).
Из лабораторных животных наиболее чувствительны к стафилококку кролики и в меньшей степени морские свинки и мыши. У кроликов при внутрикожном введении культуры появляется резко выраженный некроз, при подкожном — развиваются абсцессы, а заражение высоковирулентными штаммами стафилококка приводит к сепсису и гибели животных. К стафилококковому энтеротоксину наиболее чувствительны котята-сосунки и молодые мыши.
Классификация стафилококков. Старая классификация стафилококков по выделяемому ими пигменту (золотистый, белый и лимонно-желтый) не дает возможности правильно определить их патогенность. Поэтому в настоящее время считают наиболее верной классификацию стафилококков, предложенную Гроссом. Согласно этой классификации, все стафилококки разделяются на три группы: патогенные, слабопатогенные и непатогенные.
Первая группа — патогенные стафилококки:
а) на чашках с 5% кровяным агаром образуют четкую зону гемолиза-
б) при внутрикожном введении кролику вызывают явления резко выраженного некроза, заканчивающегося иногда смертью животного-
в) продуцируют фермент плазмокоагулазу, вызывающую свертывание плазмы в течение 2 часов-
г) выделяются главным образом от больных сепсисом или острой гнойной инфекцией.
Вторая группа — слабопатогенные стафилококки:
а) на чашках с кровяным агаром образуют зону слабовыраженного неполного гемолиза-
б) при внутрикожном введении кролику вызывают в месте введения покраснение кожи, иногда инфильтрат, чаще без явлений некроза-
в) при посеве в цитратную плазму вызывают свертывание в течение 6 часов и позже-
г) выделяются с поверхности кожи при фолликулите, со слизистых оболочек при катаре верхних дыхательных путей, с поверхности ран, но не из глубины их.
Третья группа — непатогенные стафилококки:
а) на чашках с кровяным агаром гемолиз не обнаруживается-
б) при внутрикожном введении кролику явления некроза и инфильтрата не отмечаются, в отдельных случаях появляется покраснение кожи-
в) реакция плазмокоагуляции отрицательная-
г) обнаруживаются постоянно на здоровой коже, на слизистых оболочках зева, носа и в воздухе.
Патогенез и заболевания у человека. Стафилококки являются очень распространенными микробами. Их находят в воздухе, воде и почве, у человека — почти постоянно на коже и слизистых оболочках. Этим объясняется тот факт, что стафилококк является наиболее частым возбудителем всевозможных нагноений. Повреждение кожи и слизистых оболочек или понижение их резистентности открывает «ворота» для стафилококковой инфекции.
Чаще всего поражается кожа. Стафилококки являются возбудителями фурункулов — гнойного воспаления волосяных мешочков. Если фурункулы приобретают множественный характер, заболевание называется фурункулезом. Когда несколько фурункулов сливаются вместе, образуя более обширный гнойный инфильтрат, возникает карбункул.
Стафилококки встречаются при абсцессах (гнойниках), в гноящихся ранах, при катарах слизистых оболочек, септицемии и септикопиемии (сепсис с образованием гнойных очагов во внутренних органах). Энтеротоксические штаммы золотистого стафилококка могут вызывать пищевые отравления. Последние наблюдаются в результате употребления зараженного стафилококком молока и других молочных продуктов, пирожных с кремом и т. д., так как в этих продуктах стафилококк находит оптимальные условия для своего размножения. В молоко патогенные стафилококки могут попасть или от коров, больных маститом, или с рук доярок, страдающих пиодермией.
Иммунитет. Врожденного иммунитета к стафилококку у людей не существует. Однако человек обладает значительной устойчивостью к этому микроорганизму, что объясняется защитной ролью кожи и наличием в крови антител.
По-видимому, может иметь место приобретенный иммунитет, о чем свидетельствует повышение титра антител у больных и переболевших. Однако этот иммунитет нестоек. Более того, отмечено, что у многих людей, перенесших фурункулез, возникает повышенная восприимчивость к стафилококку.
Сопротивляемость к стафилококку может ослабляться вследствие разных причин — диабета, травмы, истощающих заболеваний и т. д.
Микробиологическая диагностика. Исследование гноя. Чаще всего материалом для микробиологического исследования служит гной. Для этой цели при открытых поражениях после предварительного очищения раневой поверхности стерильным ватным тампоном достают отделяемое из более глубоких частей раны. При закрытых процессах (фурункул, абсцесс) с этой же целью после дезинфекции кожи производится пункция очага нагноения стерильным шприцем. Из полученного гноя делают мазки, окрашивают синью и по Граму и микроскопируют.
По расположению кокков и тинкториальным свойствам трудно дифференцировать стафилококки и стрептококки, поэтому переходят к бактериологическому исследованию, т. е. к посеву гноя на чашки с простым, кровяным агаром, на желточно-солевой агар (см. раздел «Санитарная микробиология» стр. 454) и на среду обогащения (сахарный бульон). Засеянные чашки, перевернув вверх дном, и бульон ставят в термостат при 37° на 1—2 суток.
На чашках с кровяным агаром колонии образуют зоны гемолиза, диаметр которых часто в несколько раз превышает диаметр колонии. Эти прозрачные бесцветные зоны гемолиза образовались вследствие растворения эритроцитов, вызванного гемотоксином стафилококка. На чашках с желточно-солевым агаром патогенные стафилококки вырастают с образованием золотистого пигмента и зоной помутнения — в виде радужного венчика вокруг колонии. С одной из колоний готовят препарат, окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение в препарате грамположительных кокков, расположенных в виде гроздей винограда, дает право выдать ориентировочный положительный результат. Затем остаток колонии пересевают на скошенный агар для получения чистой культуры. Необходимо дифференцировать патогенный стафилококк от непатогенного, т. е. изучить рост на кровяном агаре, желточно-солевом агаре, посеять в нитратную плазму и определить токсигенность на животных.
Проба на плазмокоагуляцию. Для реакции плазмокоагуляции Г. В. Выгодчиков рекомендует следующую методику. У кролика берут 10 мл крови из сердца, помещают в пробирку с 1 мл 5% раствора лимоннокислого натрия. Кровь центрифугируют и отсасывают плазму. Полученную плазму перед опытом разводят физиологическим раствором 1 :4 и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл. Колонии стафилококков засевают петлей в пробирки с нитратной кроличьей плазмой, ставят в термостат при 37° и проверяют свертывание плазмы каждые 2—3 часа. Патогенные стафилококки коагулируют плазму в течение 2—10 часов чаще всего в течение 4 часов.
Проба на токсигенность. Токсигенность стафилококковых культур определяется опытом на кроликах, а энтеротоксин — на котятах-сосунках. Из туры стафилококка на скошенном агаре приготовляют взвесь микробов в физиологическом растворе и устанавливают по оптическому стандарту с расчетом 2 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси. На боку или спине у кролика выщипывают шерсть и внутрикожно вводят животному по 0,2 мл микробной взвеси. При положительной реакции на месте инъекции образуется инфильтрат, а затем и некроз.
Для обнаружения летального токсина кролику внутривенно вводят фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,75 мл на 1 кг веса. Смерть животного наступает через 15 минут.
Для определения энтеротоксина котят 1,5—2-месячною возраста (весом 400 г) вскармливают исходным зараженным продуктом или молочной культурой стафилококка. Признаки отравления (понос, иногда рвота) наступают через 30—60 минут. Наблюдение ведут 4— 6 часов, и если за это время у котят не будет никакой реакции, биологическая проба считается отрицательной.
Исследование крови. При подозрении на сепсис у больного из локтевой вены стерильно с помощью шприца берут 10 мл крови и засевают в 100—200 мл сахарного бульона. Посев ставят для обогащения на 24—48 часов в термостат. В положительном случае среда мутнеет, а в мазках из нее обнаруживаются грамположительные кокки, имеющие характерную форму и расположение. Из бульона делают пересев в чашку с кровяным агаром и дальнейшее исследование ведут так, как описано выше. Бульон выдерживают в термостате 10 суток, производя каждые 2 дня высев на 5% кровяной агар.
Исследование других материалов. При исследовании материалов, загрязненных большим количеством посторонних микробов (испражнения, мокрота), рекомендуется применять агар с 7,5% хлорида натрия, к которому добавляют 10% теплого снятого молока (среда Петрович). На таком агаре рост посторонней микрофлоры значительно подавляется.
Фаготипирование. При фаготипировании используют набор типовых стафилококковых фагов, состоящих из 21 фага, разделенных на четыре группы. Каждый типовой фаг способен размножаться только на соответствующем ему штамме стафилококка. Фаготипирование стафилококков имеет особое значение при са-
санитарно-бактериологическом исследовании пищевых продуктов для выявления источника инфекции и установления эпидемических связей.
Специфическая терапия и химиотерапия. Стафилококковая вакцина широко применяется для лечения рецидивирующих и хронических инфекций, например, при фурункулезе. Для профилактики этих заболеваний применяется анатоксин.
При лечении стафилококковых инфекций с успехом используют также химиотерапевтические препараты сульфаниламидного ряда (норсульфазол, сульфодимезин и др.), антибиотики (пенициллин в больших дозах, эритромицин, оксациллин и др.), стафилококковый бактериофаг (при поражениях кожи). При тяжелых стафилококковых сепсисах рекомендуются гипериммунная антистафилококковая плазма и гамма-глобулин, получаемые от доноров, иммунизированных анатоксином.
