Возбудители брюшного тифа и паратифов - микробиология с техникой микробиологических исследований

Бактерии брюшного тифа и паратифов вызывают заболевания, сходные по патогенезу, клинике и эпидемиологии. Возбудитель брюшного тифа впервые описан Эбертом в 1880 г., паратифозные бактерии — Ашаром и Бансодом (1896), и дифференцированы Шоттмюллером на два вида: S. paratyphi А. и S. schottmulleri.
В современной систематике бактерии брюшного тифа, паратифов и возбудители пищевых токсикоинфекций на основании их антигенной структуры и других признаков объединены в один род Salmonella (в честь бактериолога Салмона).
Морфология. Палочки по величине и форме сходны с кишечными, имеют в среднем от 2 до 3 мк в длину и от 0,5 до 0,7 мк в толщину (см. рис. 78). Спор и капсул не образуют, хорошо подвижны, грамотрицательны.
Культуральные и биохимические свойства. Тифозные и паратифозные бактерии растут на простых питательных средах в аэробных условиях. Оптимум роста между 30 и 37°.

Рис. 79. Сальмонеллы паратифа Б. Колонии на мясо-пептонном агаре. Ув. 12
На чашках с агаром колонии палочки брюшного тифа и паратифов имеют вид умеренно выпуклых влажных прозрачных дисков, более мелких и нежных, чем колонии кишечной палочки (рис. 79). Колонии палочки паратифа В отличаются характерной особенностью строения, которая заключается в образовании по периферии колонии приподнятого слизистого валика, окружающего плоский центр колонии наподобие бортика пуговицы. Валик появляется при хранении посевов (после 24-часового стояния в термостате) в течение нескольких последующих дней при комнатной температуре.
Колонии тифозной и паратифозных палочек, выделенные в начале и в разгаре болезни, имеет гладкую форму (тип S), а полученные в стадии выздоровления часто растут в виде шероховатых форм (тип R), состоящих из маловирулентных бактерий.
При посеве штрихом на скошенном агаре получается сплошной по черте рост, сначала нежный с голубоватым отливом, затем грубый, но нежнее роста кишечной палочки. На бульоне появляется диффузный рост.
На молоке тифозные и паратифозные палочки обильно размножаются, причем молоко не створаживается. Лактозу они не сбраживают, а глюкозу, мальтозу и маннит разлагают брюшнотифозные бактерии только до кислоты, паратифозные до кислоты и газа. Ферментативные свойства паратифозных бактерий в общем сходны, но бактерии паратифа А менее активны, газообразование незначительно и появляется позже.

Биохимические свойства бактерий кишечно-тифозной группы

Условные обозначения: К — образование кислоты- Г — образование газа- — отсутствие реакции- + наличие реакции.

Бактерии В на лакмусовом молоке вызывают щелочение, которое выражается сначала в появлении на поверхности среды синего ободка по краям пленки, a затем происходит окрашивание всей среды в синий цвет. Палочки брюшного тифа и паратифа А вызывают на лакмусовом молоке слабое кислотообразование, которое проявляется легким порозовением среды (табл. 12).
Антигенная структура. Бактерии брюшного тифа, паратифов и возбудители пищевых токсикоинфекций характеризуются наличием соматического О-антигена и жгутикового Н-антигена. Кроме этих двух антигенов, Феликс и Питт обнаружили у брюшнотифозной палочки дополнительный антиген—антиген вирулентности (V1-антиген). Как соматический, так и жгутиковый антигены сложны по составу. Изучение состава этих антигенов позволило Кауфману и Уайту составить схему классификации всей группы сальмонелл. В основу этой классификации положены различия в строении О-антигенов, которые дали возможность разбить сальмонеллы на ряд серологических групп (А, В, С, D, Е и т. д.). Бактерии каждой группы имеют общие соматические антигены. Например, брюшнотифозная палочка (группа D) содержит три различных О-антигена (9, 12 и Vi). Жгутиковый (Н) антиген тоже неоднороден. Различия в Н-антигенах, как специфических (I фаза), так и неспецифических (II фаза), позволило внутри отдельных групп дифференцировать типы (см. табл. 12). Специфическая фаза Н-антигена агглютинируется специфической видовой сывороткой, неспецифическая агглютинируется не только видовой, но и групповой сывороткой.
Схема Кауфмана и Уайта позволяет реакцией агглютинации на стекле идентифицировать бактерии рода Salmonella. Для этого необходимо иметь набор монорецепторных сывороток (анти-О- и анти-Н-антигенов). О-сыворотки соответствуют отдельным группам (А, В, С и т. д.) схемы Кауфмана и Уайта. Н-монорецепторные сыворотки соответствуют специфической фазе жгутикового антигена: а, в, с, d, g, m и т. д. Сыворотки применяются в неразведенном виде.
При идентификации на предметное стекло наносят капли групповых О-сывороток. В каждой капле петлей эмульгируют небольшое количество исследуемой агаровой культуры, снятой с верхней части скошенного агара. Появление агглютината в той или иной капле указывает на группу, к которой принадлежит культура. Затем ставят реакцию агглютинации с Н-сыворотками, содержащих антитела против Н-антигенов специфической фазы сальмонелл, виды которых входят в данную группу. Микробную массу в этом случае следует брать с нижней части скошенного агара и конденсационной воды. При наличии агглютинации определяют антиген специфической фазы и тем самым вид культуры.
Резистентность. Прямой солнечный свет убивает микробов тифо-паратифозной группы в течение 4—8 часов. Низкие температуры они переносят длительное время, сохраняя жизнеспособность на льду в течение нескольких недель и месяцев. Культуры тифозной и паратифозной палочек при нагревании до 60—65° гибнут через час.
Тифо-паратифозные бактерии устойчивы к высыханию, могут сохраняться долго в почве, сточных и речных водах и на различных продуктах питания: мясе, молоке, овощах и т. д. Быстрое губительное действие оказывают на них дезинфицирующие вещества (5—10% раствор хлорной извести, фенола, лизола и других веществ).
Патогенность для животных и токсинообразование.
В естественных условиях брюшным тифом и паратифом болеют только люди. Лабораторные животные не чувствительны к бактериям брюшного тифа и паратифов. Истинные токсины на питательных средах не получены.
Патогенез и клиника. Источником инфекции при брюшном тифе и паратифах является больной человек и бактерионоситель, которые выделяют палочки с испражнениями и мочой. Заражение может происходить как контактно-бытовым путем (от больных, реконвалесцентов и бактерионосителей), так и через воду и пищевые продукты. Попадая через рот в желудок, бактерии брюшного тифа и паратифов подвергаются неблагоприятному воздействию кислой реакции желудочного сока и часто гибнут. Только минуя этот первичный барьер (при пониженной кислотности желудочного сока, при обильном питье и т. д.), палочки оказываются в тонком кишечнике, слизистая которого и является входными воротами инфекции.
В кишечнике часть их погибает, а другая проникает в лимфатический аппарат тонкого кишечника (солитарные фолликулы и пейеровы бляшки), а затем в регионарные (брыжеечные) лимфатические узлы. Здесь бактерии усиленно размножаются и подавляя их барьерную функцию прорываются в кровяное русло. Эта фаза называется
бактериемической и знаменуется появлением начальных симптомов болезни. Бактериемия — важнейший элемент инфекционного процесса при брюшном тифе и паратифах, который имеет место на протяжении всего периода заболевания. Вследствие частичной гибели микробов в крови и лимфатических узлах освобождаются эндотоксины, вызывающие интоксикацию организма, которая отражается в клинической картине заболевания. С кровью палочки разносятся по всему организму и фиксируются в клетках ретикулоэндотелиальной системы лимфатических узлов, костного мозга, печени и др. органов.
Наступает фаза паренхиматозной диффузии. Этим ограничивается распространение возбудителя в организме, генерализованная инфекция превращается в локализованную (А. Ф. Билибин). Защитная реакция организма, которая выражается в нарастании фагоцитарной активности клеток ретикулоэндотелия и выработке ими специфических антител влечет за собой освобождение крови и паренхиматозных органов от микробов. Главная роль в этом отношении принадлежит почкам и печени. Сохраняются они в большом количестве в содержимом кишечника и в желчном пузыре, так как желчь ослабляет действие антител и является хорошей питательной средой для размножения тифозных и паратифозных палочек. Иногда после полного выздоровления бактерии в течение нескольких лет могут оставаться жизнеспособными в желчном пузыре и такие люди становятся возможными источниками инфекции.
Инкубационный период равен 10—21 дню. Начало заболевания характеризуется постепенным подъемом температуры при явлениях нарастающего отравления эндотоксином. Последнее выражается в появлении головной боли, общей слабости, бессонницы, помрачении сознания и бреда. Такое состояние определяется термином Status typhosus (по-гречески typhos — туман). Температура постепенно поднимается с каждым днем на 1-й неделе до 40°, держится на этой высоте в течение 10—14 дней, а на 4-й неделе постепенно начинает спадать. К концу 1-й недели болезни прощупываются увеличенные селезёнка и печень, на 8—10-й день появляется пятнистая сыпь (розеолы), исчезающая при надавливании.
Характерный патоморфологический процесс при брюшном тифе разыгрывается в кишечнике. На первой неделе заболевания тифозные бактерии вызывают острое воспаление лимфатического аппарата кишечника, в результате чего пейеровы бляшки и солитарные фолликулы увеличиваются в объеме и набухают. Тифозные бактерии, являясь аллергенами, одновременно сенсибилизируют эти образования. На 3-й и 4-й неделе заболевания тифозные бактерии с желчью снова попадают в кишечник, проникают в сенсибилизированные пейеровы бляшки и солитарные фолликулы и вызывают в них аллергическую реакцию, которая выражается в некрозе этих образований. Эта фаза называется выделительно-аллергической. Некротические массы пейеровых бляшек и солитарных фолликул отпадают, что приводит к образованию тифозных язв в кишечной стенке. При благоприятном течении болезни происходит заживление этих язв без всяких осложнений. В тяжелых случаях возникают кишечные кровотечения, а при глубоком язвенном процессе может произойти прободение кишечника (перфорация) с последующим перитонитом.
Заканчивается заболевание фазой реконвалесценции и восстановлением физиологического равновесия организма.
Паратифозные заболевания протекают менее тяжело и менее продолжительно (особенно паратиф В) и не дают тех тяжелых осложнений, которые имеют место при брюшном тифе.
Иммунитет. Перенесенные брюшной тиф и паратифы оставляют после себя иммунитет, хотя наблюдаются случаи повторных заболеваний. В крови переболевших имеются антитела: агглютинины, преципитины, бактериолизины и др.
Микробиологическая диагностика. Для диагностики брюшного тифа и паратифов применяют: бактериологический метод исследования и серологический. Бактериоскопический метод является вспомогательным, ориентировочным, так как все бактерии тифо-паратифозной группы обладают общими морфологическими и тинкториальными свойствами.

1. Бактериологический метод. Для исследования берут кровь, пунктат костного мозга, кал, мочу, содержимое розеол.

В первые дни заболевания (и на протяжении всего периода болезни) исследованию подвергается кровь больного с целью обнаружения в ней возбудителя, так
как первая стадия заболевания, как было указало выше, характеризуется бактериемией.
Этот метод ранней диагностики брюшного тифа носит название метода гемокультур. Метод гемокультур впервые был введен в микробиологическую практику русским врачом Вильчуром в 1887 г.
Кровь для посева берут из вены, причем засевают большие количества крови — не менее 8—10 мл, так как число возбудителей, циркулирующих в крови, может быть очень незначительным. Кровь непосредственно у постели больного засевают в колбу, содержащую 100 мл желчного бульона (с 10—20% желчи). При отсутствии желчи посев крови можно сделать на 75—100 мл стерильной дистиллированной воды.
Возбудители брюшного тифа и паратифов находятся в крови на протяжении всего лихорадочного периода, но количество их все время уменьшается. Поэтому со 2-й недели заболевания следует производить посев 15— 20 мл крови.
Посевы помещают в термостат на 24—48—72 часа для обогащения, после чего производят пересев на чашку со средой Эндо и на скошенный агар (2-й день исследования). Посев на чашку позволяет выделить чистую культуру возбудителя при загрязнении среды накопления сапрофитной флорой. Через 18—24 часа инкубации в термостате изучают посев на скошенном агаре и на среде Эндо. Если на скошенном агаре выросла чистая культура — нежный, полупрозрачный налет — приступают к ее идентификации. К изучению посева на чашке прибегают в том случае, если на скошенном агаре загрязненный рост. Тогда из бесцветных колоний делают пересев на скошенный агар.
Выделенную культуру (3-й день исследования, а при пересеве с чашки со средой Эндо — 4-й день) идентифицируют посевом иа среду Ресселя, содержащую мясо- пептонный агар, глюкозу (0,1%), лактозу (1°/о), индикатор Андреде, или по пестрому ряду углеводов и реакцией агглютинации адсорбированными сальмонеллезными поливалентными и монорецепторными сыворотками. Если агглютинация с О-сыворотками не произошла, следует поставить опыты с Vi-сыворотками или разрушить Vi-антиген. Этого достигают путем прогрева культуры при 60° в течение 30 минут или при 100° в течение 5 минут. На следующий день производят учет изменений сред
пестрого ряда углеводов, окончательный учет реакций агглютинации и выдают результат исследования.
Метод гемокультуры может быть применен на протяжении всего лихорадочного периода («всегда, когда у больного повышена температура» — А. Ф. Билибин), но процент высеваемости брюшнотифозных бактерий неодинаков. Так, на первой неделе заболевания гемокультура бывает положительной в 90—100% случаев, с 8-го до 15-го дня — в 70—80%, а в последующие дни — в 40—60% случаев.
Большую диагностическую ценность имеет посев пунктата костного мозга — метод миелокультуры.
При помощи иглы Раскина делают прокол грудины и извлекают 0,5—0,75 мл пунктата костного мозга и засевают в 3 мл желчи или во флакон с желчным бульоном. Дальнейшее исследование ведется аналогично исследованию на гемокультуру.
Начиная с конца 2-й и в течение 3-й недели производят исследование испражнений и мочи больного — метод копрокультуры и уринокультуры.
Испражнения больных собирают в подкладное судно, которое должно быть тщательно промыто кипяченой водой. Фекалии в количестве 10 г переносят стерильной деревянной палочкой в стерильную баночку со стеклянной или корковой пробкой. Исследуемые испражнения эмульгируют в 15 объемах физиологического раствора (жидкие испражнения разводят меньше) и подвергают отстаиванию в течение получаса для оседания тяжелых частиц. Затем испражнения засевают на чашки со средой Эндо, Левина и др. Одновременно с этим производят посев 1—2 г плотных или 1—2 мл жидких испражнений на 10 мл жидкой обогатительной среды. Дальнейший ход исследования мочи и кала такой же, как и при выделении гемокультуры.
В качестве обогатительных сред применяют среду Мюллера, Кауфмана и др.
Среда Мюллера. В стерильный флакон емкостью 200 мл насыпают 4,5 г химически чистого мела и стерилизуют сухим жаром. Затем во флакон наливают 90 мл мясо-пептонного бульона и стерилизуют 20 минут при 120°. Отдельно приготовляют: а) раствор гипосульфита (50 г в 100 мл дистиллированной воды простерилизовать текучим паром 30 минут)- б) раствор йода в йодистом калии (кристаллического йода 25 г, йодистого калия 20 г и дистиллированной воды 100 мл). Перед самым употреблением в колбочку с 90 мл бульона прибавляют 10 мл раствора гипосульфита и 2 мл раствора йода в йодистом калии, смешивают и вносят 2—3 г испражнений.

Плотные испражнения предварительно растирают с двойным— тройным объемом физиологического раствора и отстаивают в течение 5 минут. Для посева берут верхний жидкий слой. Свежеприготовленную среду можно разлить по 10 мл в пробирки, в которые засевают по нескольку капель испражнений.
Среда Кауфмана. К 100 мл среды Мюллера прибавляют 5 мл стерильной желчи и 1 мл раствора краски бриллиантгрюн 1 :1000.
Копрокультура дает положительный результат только в 30—40% случаев и в поздние сроки (на 3—4 неделе заболевания), в связи с чем этот метод редко применяется с диагностической целью.
Мочу для посева собирают в стерильные пробирки (10—15 мл) стерильным катетером или при естественном мочеиспускании после тщательной очистки и дезинфекции окружности наружного отверстия мочеиспускательного канала. Сначала производят посев нескольких капель мочи на чашку с агаром Плоскирева, затем мочу центрифугируют и снова сеют осадок на чашку с агаром Плоскирева и на среду накопления (желчный бульон).
Можно исследовать на наличие бактерий тифо-паратифозной группы лимфу из розеол. При подозрении на бактерионосительство исследованию подвергается кал, моча и дуоденальное содержимое. При исследовании кала обследуемый принимает натощак 30 г сернокислого натрия или сернокислой магнезии, растворенной в 100—250 мл теплой воды. Материал для Исследования собирают в стерильную баночку.
Серологический метод. Серологическая диагностика брюшного тифа и паратифов основана на постановке реакции агглютинации, введённая в практику французским микробиологом Видалем и названная его именем. Реакция Видаля ставится со 2-й недели заболевания (8—10-й день), так как к этому времени в крови больного накапливается достаточное количество агглютининов. Для реакции берут 2—3 мл крови из локтевой вены. При невозможности пунктировать вену следует брать кровь из пальца или мочки уха (20—30 капель).
Реакция Видаля может быть поставлена капельным или объемным способом. Капельный способ удобен, когда сыворотка больного имеется в ограниченном количестве и когда не требуется многих ее разведений. Объемный способ имеет преимущество при массовой постановке реакций и при необходимости определить действие сыворотки в больших разведениях. При капельном
способе готовят основное разведение сыворотки 1:20 (1 капля сыворотки+19 капель физиологического раствора). Опыт ставят в 5 агглютинационных пробирках. Пастеровской пипеткой накапывают физиологический раствор по такому расчету: 14, 16, 17, 18 и 10 капель. Затем той же пипеткой добавляют основное разведение сыворотки: 4, 2, 1 и 10 капель. Микробную взвесь (диагностикум) по 2 капли добавляют во все пробирки кроме последней и учитывают ее как жидкость при разведении. Схема реакции Видаля будет представлена следующим образом (табл. 13).
Таблица 13
Схема реакции Видаля

Степень разведения сыворотки определяется следующим образом. Подсчитывают общее количество капель жидкости в пробирке и полученное число делят на количество капель разводимой сыворотки. В приведенной выше схеме в первой пробирке общее количество капель 20, количество капель сыворотки — 4. Если разделить 20 на 4, получится разведение сыворотки 1:5. Но так как в 1-ю пробирку была налита не цельная сыворотка, а предварительно разведенная 1 :20, то, перемножив эти две степени разведения (1:20 и 1:5), получим общее разведение 1 : 100.
Объемный способ более удобен и имеет широкое применение. При этом способе реакция ставится в обыкновенных бактериологических пробирках. В штатив устанавливают необходимое количество пробирок. Во все пробирки, кроме 1-й, отмеривают по 1 мл физиологического раствора. Из предварительно приготовленной диагностикум ОН, во второй ряд — О-антиген, в третий паратифозный А-диагностикум и в четвертый паратифозный В-диагностикум. О-антигены (диагностикумы) готовят кипячением культуры или обработкой ее спиртом, ОН-антиген (диагностикум)—обработкой культуры формалином.
При чтении результатов реакции Видаля пробирки не следует сильно встряхивать, так как образовавшиеся хлопья нежные и легко разбиваются. Учет реакции производится по схеме, изложенной на стр. 169.
Диагностическое значение в реакции Видаля имеет агглютинация, начинающаяся с разведения сыворотки 1 :200, так как тифо-паратифозные агглютинины нередко обнаруживаются у здоровых людей, ранее не болевших брюшным тифом и не вакцинировавшихся против него (нормальные агглютинины), но их титр обычно не превышает 1 : 25—1 : 50.
Если происходит групповая агглютинация с двумя или тремя антигенами, то за возбудителя болезни принимают того микроба, с которым произошла агглютинация в наиболее высоком разведении сыворотки. Положительную реакцию Видаля могут дать также сыворотки людей, вакцинированных против брюшного тифа и паратифов (прививочная реакция), и сыворотки людей, ранее переболевших брюшным тифом — анамнестическая реакция. Для того чтобы дифференцировать инфекционную реакцию Видаля от «прививочных» и «анамнестических», прибегают к повторной постановке ее через 5—6 дней. Если исследуемый болен брюшным тифом или паратифом, то за это время количество антител увеличится и повторная реакция даст положительный результат с более высоким титром сыворотки по сравнению с предыдущей. При «прививочной» или «анамнестической» реакции титр антител не изменится.
Кроме того, отличить инфекционную реакцию Видаля от «прививочной» и «анамнестической» можно также при постановке реакции отдельно с ОН и О-антигеном (для чего последняя и применяется), определив, за счет каких (О- или Н-) агглютининов положительна эта реакция. Дело в том, что в ходе накопления агглютининов при брюшнотифозной инфекции наблюдается определенная последовательность: в разгар болезни в организме больного накапливаются тифозные О-агглютинины, которые с переходом в выздоровление вскоре исчезают и
их место занимают Н-агглютинины. Точно так же после искусственной иммунизации (вакцинации) к брюшному тифу в крови привитых О-антитела обнаруживаются недолго, а длительно сохраняются только Н-агглютинины.
Реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации. При обследовании лиц, подозрительных на носительство брюшнотифозных палочек, ставят реакцию агглютинации с сывороткой носителя и Vi-антигеном или более чувствительную реакцию — непрямой (пассивной) гемагглютинации. Эта реакция основана на способности эритроцитов, обработанных танином и с адсорбированным на них Vi-антигеном брюшнотифозных палочек, склеиваться при воздействии сыворотки, содержащей агглютинины к этому антигену. Для реакции используют эритроциты кур, барана или человека (О—группы). Техника реакции заключается в следующем. Исследуемую сыворотку нагревают 30 минут при 56°, разводят физиологическим раствором от 1 : 50 до 1 : 1600 и наливают в ряд пробирок по 0,5 мл в каждую различных ее разведений и по 2 капли стандартного эритроцитарного Vi-диагностикума. Пробирки оставляют при комнатной температуре или в термостате на 24 часа, а затем производят учет реакции. Выпадение эритроцитов в осадок (гемагглютинация) свидетельствует о наличии антител в исследуемой сыворотке.
При диагностике брюшного тифа и паратифов можно поставить реакцию нарастания титра фага. Эта высокочувствительная реакция  позволяет быстро (в течение 10—16 часов) выявить в материале такие небольшие количества бактерий, которые не обнаруживаются бактериологическим методом. Методика этой реакции аналогична методике, применяемой при дизентерии, с той только особенностью, что исследуемый материал с индикаторным фагом выдерживается в термостате до 16 часов вместо 4—5 часов при диагностике дизентерии.
Фаготипирование брюшнотифозных палочек. Исследованиями советских и зарубежных авторов установлено, что у брюшнотифозных бактерий, содержащих Vi-антиген, существует связь между антигенной структурой и их способностью лизироваться бактериофагом. Различают две разновидности фагов:
первую — Vi-1 фаги лизируют почти все Vi-формы палочек брюшного тифа (универсальный)-
вторую — Vi-2 фаги лизируют только те штаммы, на которых пассировались.
В настоящее время насчитывают 78 фаготипов бактерий брюшного тифа. Они стабильны и не изменяются ни в организме человека, ни во внешней среде. При помощи типовых фагов можно установить фаготип возбудителя, что имеет большое практическое значение, позволяя вскрыть эпидемиологическую цепь. Например, обнаружение бактерий брюшного тифа одного и того же фаготипа у бактерионосителя на молочной ферме, в молоке и у больных, питавшихся этим молоком, помогает в этом случае установить источник и пути передачи инфекции.
Техника фаготипирования следующая. Трех-четырехчасовую бульонную культуру возбудителя тонкой платиновой петлей или тонкой пастеровской пипеткой засевают на хорошо подсушенные чашки с агаром в виде секторов или кружочков по числу имеющихся типов фага. Чашки ставят в термостат на 30 минут для подсушивания. Затем на высохшие капли испытуемой культуры петлей наносят одинаковые объемы типовых фагов (Vi-2) в критическом тест-разведении. Обычно тест-разведение, т. е. рабочая доза, указывается на этикетке ампулы с фагом. Основной фаг разводят бульоном до указанного разведения. Чашки снова ставят в термостат на ночь и определение фаготипа производят в соответствии со схемой, прилагаемой к наборам выпускаемых бактериофагов.
Специфическая профилактика и терапия. Специфическая профилактика осуществляется химической вакциной TABte, в состав которой входят полные антигены палочки брюшного тифа, паратифа А и В и столбнячный анатоксин.
Специфическое лечение больных брюшным тифом и паратифами осуществляется антибиотиками: левомицетином, синтомицином, хлортетрациклином и др.