Приобретенный иммунитет - микробиология с техникой микробиологических исследований

Иммунитет, возникающий в результате инфекционного процесса или при искусственном введении в организм веществ антигенного характера, обычно называют постинфекционным и соответственно поствакцинальным. И при этом иммунитете по существу действуют те же регуляторные механизмы, что и при естественном иммунитете, т. е. процессы выделения, фагоцитоз, реактивность организма в целом, защитные свойства кожи и слизистых оболочек. Образование антител, которое обычно считают специфической формой защиты, также можно рассматривать с точки зрения физиологических функций организма.

АНТИГЕНЫ И АНТИТЕЛА

Антигенами называются вещества, обладающие способностью при поступлении в организм вызывать в нем образование антител.
Основным свойством антигенов является способность их вызывать образование специфических антител и реагировать с уже образовавшимися антителами. Необходимым условием проявления антигенного действия является: 1) чужеродность (гетерогенность) данного антигена для организма- 2) введение антигена парентерально (минуя желудочно-кишечный тракт).
Антигены бывают полноценными и неполноценными.
Полноценные антигены способны вызывать образование антител и вступать с ними в реакцию. Полноценными антигенами являются главным образом вещества белковой природы, причем они должны быть в коллоидном состоянии и растворимы в жидкостях организма.
Неполноценные антигены, или гаптены, вступают в реакцию с антителами, но не способны вызывать в организме образование антител. Неполноценными антигенами являются липоиды, высокомолекулярные углеводы и ряд других веществ. Гаптены становятся полноценными антигенами, т. е. приобретают способность вызывать образование антител, при добавлении к ним некоторого, хотя бы очень незначительного, количества белка.
Бактериальная клетка в связи со сложностью ее структуры состоит из большого числа как полноценных антигенов — белков, так и неполноценных антигенов — гаптенов. Подвижные бактерии обладают двумя антигенами — термолабильным (разрушающимся при температуре 80°), связанным с жгутиками и носящим название жгутикового (Н-антигена) и термостабильным (не разрушающимся при температуре 80—100°), связанным с цитоплазмой бактерий, так называемым соматическим (О-антиген). С потерей подвижности Н-антиген утрачивается. При иммунизации подвижными бактериями образуются антитела и к тому и к другому антигену.
Получаемый при экстрагировании трихлоруксусной кислотой из бактерий соматический антиген состоит из липоидополисахаридопротеинового комплекса (полный антиген). У брюшнотифозной палочки, у бактерий, вызывающих пищевое отравление, помимо Н- и О-антигенов, установлен еще один особый антиген — антиген вирулентности (Vi-антиген). Бактерии, образующие капсулу, обладают специфическим капсульным антигеном, отличающимся от антигенов самой клетки.
Антителами называются вещества белковой природы, образующиеся в организме при парентеральном введении антигенов.
Антитела характеризуются тем, что соединяются только с теми антигенами, против которых они выработаны организмом (специфичность антител):
Антитела могут содержаться в небольшом количестве в сыворотке здоровых, неиммунизированных людей (нормальные антитела). Количество аитител в сыворотке (ее титр) значительно увеличивается в результате инфекции или искусственной иммунизации.
Антитела вступают в определенную реакцию с антигеном, которая характеризуется различными внешними проявлениями. Так, при смешивании иммунной сыворотки с бактериями можно наблюдать феномен склеивания взвешенных в жидкости микробов с последующим выпадением их в осадок (агглютинация), при определенной постановке опыта — растворение микробов (бактериолиз). При смешении сыворотки перенесшего дифтерию с токсином дифтерийной палочки можно обнаружить нейтрализацию ядовитого действия токсина (антитоксическое свойство сыворотки). Иммунная сыворотка при взаимодействии с антигенами, находящимися в растворенном состоянии, дает реакцию осаждения — преципитации. При иммунизации вырабатываются антитела, повышающие фагоцитарную функцию (опсонины и тропины), и антитела, связывающие комплемент, а при введении чужеродных эритроцитов в сыворотке накапливаются антитела — гемолизины, дающие гемолиз.
Таким образом, в зависимости от способа действия на антиген и внешнего проявления реакции различают следующие антитела: антитоксины (нейтрализующие токсин), агглютинины (вызывающие склеивание и осаждение бактерий), бактериолизины (растворяющие бактерий), бактерицидные (убивающие бактерий), вируснейтрализующие антитела, преципитины (вызывающие со специфическим антигеном образование осадка — преципитата), опсонины и тропины (повышающие фагоцитарную функцию), гемолизины (вызывающие растворение эритроцитов), комплементсвязывающие антитела и др.

Механизм образования антител

Антитела образуются только в организме человека или животного.
Существует множество теорий и гипотез, объясняющих механизм образования антител. Согласно современным данным иммунные противотела являются видоизмененными глобулинами сыворотки крови, отличающимися от нормальных наличием активных центров, ответственных за соединение с антигеном, и образуются в лимфоидной ткани: лимфатических узлах, селезенке, печени, эндотелии сосудов, костном мозге и т. д., т. е. в тех же органах, где синтезируются нормальные глобулины сыворотки. Однако роль различных клеточных элементов лимфоидной ткани в этом процессе неодинакова. Основное значение в выработке антител принадлежит плазматическим клеткам. При иммунизации восприятие антигенного раздражения осуществляется макрофагами, которые затем передают информацию об антигене различным клеткам лимфоидной ткани, способным образовывать специфические глобулины (антитела), т. е. антигену принадлежит непосредственная, формирующая роль в синтезе антител. Этим и объясняется специфический характер антител и их способность соединяться с антигеном как in vivo (в организме), так и in vitro (в пробирках).
Образование антител и выделение их клетками происходит в две фазы. В первой индуктивной (латентной) фазе происходит синтез антител, во второй— продуктивной выделение антител из лимфоидных органов в кровь. Активность лимфоидной ткани стимулируется гормоном зобной железы.
Большим признанием пользуется клонально-селекционная теория Бернета. Согласно этой теории в организме животных и человека в норме существуют клетки, способные синтезировать антитела. Антиген только селекционирует и стимулирует деятельность этих клеток.
Антитела при заболевании или иммунизации образуются не сразу, а после определенного промежутка времени, во время которого происходит иммунологическая перестройка организма для ответного синтеза иммунных глобулинов — антител. Обычно при инфекционных заболеваниях антитела появляются через 5—6 дней, а при иммунизации анатоксином через 2—4 недели. Титр антител постепенно нарастает, достигая наибольшего показателя к концу болезни, а при иммунизации в разные сроки от 2—3 недель до 2—3 месяцев. Затем количество антител снижается, вначале быстро, затем медленно Они могут совершенно исчезнуть или в определенном количестве остаться в организме. Время появления антител, их титр зависят как от характера антигена, так и от индивидуальных особенностей макроорганизма.

Реакции иммунитета и техника серологических исследований

Серологический метод исследования основан на специфическом взаимодействии иммунной сыворотки с соответствующим антигеном (взвесь микробов в физиологическом растворе хлористого натрия, экстракты, токсины).
Форма проявления взаимодействия антигена с антителом различна и зависит от структуры антигена и от среды, в которой происходит их соединение. Внешнее проявление реакции может быть в виде склеивания микробов, т. е. агглютинации, преципитации (или осаждения), растворения микробов (или бактериолиза) и т. д. Указанные иммунологические реакции специфичны и весьма чувствительны, поэтому серологический метод исследования получил широкое применение.
Реакции иммунитета широко используются с диагностической целью и при производстве лечебных сывороток и вакцин.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином
Антитоксины это антитела, способные соединяться с экзотоксинами и нейтрализовать их. Антитоксические свойства сывороток демонстративнее всего обнаруживаются в эксперименте на животных, чувствительных к соответствующему экзотоксину. При смешивании больших доз токсина с достаточным количеством иммунной антитоксической сыворотки наступает нейтрализация токсина, и такая смесь при введении чувствительному животному не вызывает болезнетворных расстройств.
Нейтрализующая сила сыворотки соответствует количеству содержащихся в ней антитоксинов. Это количество определяется условными единицами. Например,
одной антитоксической единицей (1 АЕ) дифтерийного антитоксина считают то количество иммунной сыворотки, которое нейтрализует 100 минимальных смертельных доз дифтерийного токсина (Dim — минимальная смертельная доза, т. е. минимальное количество токсина, которое убивает морскую свинку весом 250 г на 2-е сутки).
При взаимодействии в пробирке специфической антитоксической сыворотки с соответствующим токсином происходит выпадение хлопьевидного осадка. Это явление носит название флоккуляции.
Для определения силы антитоксической сыворотки Рамон предложил использовать явление флоккуляции. Для этого в ряде пробирок смешивают определенные количества токсина со все убывающими дозами антитоксической сыворотки. В пробирке, где происходит полная нейтрализация токсина, выпадает осадок и просветление жидкости наступает раньше, чем в других пробирках — происходит инициальная (первичная) реакция флоккуляции.
Явление флоккуляции практически используют в сывороточном производстве при определении силы антитоксической сыворотки.

Реакция агглютинации
При добавлении к взвеси бактерий гомологичной иммунной сыворотки наступает постепенное скучивание бактерий с образованием видимых простым глазом комочков, состоящих из бактериальных тел и оседающих на дно пробирки. Такое явление получило название реакции агглютинации (рис. 53 и 54). Эта реакция с успехом применяется для диагностики бактериальных инфекций. При иммунизации подвижными бактериями вырабатываются агглютинины как против жгутикового, так и против соматического антигена (жгутиковые или Н-агглютинины, и соматические, или О-агглютинины), причем эти два типа агглютининов имеют различный характер.

Рис. 53. Реакция агглютинации при наблюдении невооруженным глазом.

Рис. 54. Реакция агглютинации при наблюдении в лупу.

Рис. 55. Агглютиноскоп.

Жгутиковые агглютинины вызывают быстрое образование рыхлых хлопьев. Соматические же агглютинины действуют медленнее, а образуемые ими скопления бактерий имеют характер мелких зерен.
Если агглютинация плохо заметна невооруженным глазом, ее можно наблюдать в агглютиноскоп (рис. 55).
Механизм агглютинации. Реакция агглютинации состоит из двух фаз: первая фаза — соединение бактерий с агглютининами, вторая — оседание бактерий под влиянием электролитов.
Защитное действие агглютининов многими оспаривается в силу того, что осажденные микробные клетки в процессе агглютинации не претерпевают заметных морфологических изменений. Они теряют подвижность, скучиваются, но остаются живыми и могут продолжать размножаться. Можно предполагать, что собранные в кучки микробы легче фагоцитируются или подвергаются воздействию других антител (например, лизинов). Таким образом, агглютинины участвуют в защите организма содружественно с другими факторами иммунитета.
Реакцию агглютинации широко используют с диагностической целью. Реакция агглютинации специфична, поэтому если сыворотка больного вызывает агглютинацию бактерий известного вида, то из этого следует, что больной, у которого взята сыворотка, страдает заболеванием, вызванным микробами того же вида. Если иммунная агглютинирующая сыворотка, полученная от животного, иммунизированного определенным видом микроба, агглютинирует культуру возбудителя, выделенного от больного, это значит, что предполагаемый микроб и бактерии, которыми производилась иммунизация, принадлежат к одному и тому же виду.
Таким образом, в одних случаях для диагностики заболевания берут сыворотку больного, а в лаборатории должна быть проверенная живая или убитая культура соответствующего микроба, в других — исследуется микроорганизм, выделенный из организма, и соответствующая иммунная сыворотка должна быть в лаборатории.
Агглютинины могут вступать в реакцию с родственными микроорганизмами, давая групповые реакции агглютинации. Это явление объясняют наличием общих групповых антигенов. Например, агглютинирующая брюшнотифозная сыворотка в малых разведениях склеивает не только брюшнотифозных, но и паратифозных бактерий.
Для постановки реакции агглютинации необходимо иметь: 1) сыворотку больного или диагностическую агглютинирующую сыворотку (полученную от иммунизированных животных)- 2) культуру микробов или антиген- 3) физиологический раствор поваренной соли, так как в бессолевой среде (дистиллированной воде) агглютинация не происходит.
Реакция агглютинации с сывороткой больного. Кровь больного получают в асептических условиях путем венепункции или укола пальца, в первом случае в количестве 2—5 мл, во втором — в количестве 1 мл. Кровь оставляют на 1 час при комнатной температуре, с помощью пастеровской пипетки отделяют сгусток фибрина от стенки пробирки и для лучшего отстаивания сыворотку помещают в ледник. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают пипеткой и переносят в другую пробирку. Пересылка сыворотки производится в запаянной ампуле или пипетке. Из полученной сыворотки приготовляют необходимые разведения (см. стр. 164).
Вторым ингредиентом (составной частью) для постановки реакции является диагностикум, т. е. взвесь убитых микробов. Готовится диагностикум путем прибавления к микробной взвеси фенола в концентрации 0,25—0,5% или формалина в концентрации 0,2—0,3%.
Реакцию агглютинации ставят в небольших агглютинационных пробирках (диаметр 0,9—1 см, длина 10 см). Используют 6—10 пробирок, в зависимости от требующихся для реакции разведений сыворотки. Так как нормальные агглютинины выявляются при незначительных разведениях сыворотки, результаты реакции учитывают при более высоких разведениях не ниже 1:50—1:100. В каждую пробирку, содержащую сыворотку в определенном разведении, добавляют 1—2 капли бактериальной взвеси и встряхиванием тщательно перемешивают содержимое пробирки, помещают в термостат на 2 часа при 37°, а затем оставляют при комнатной температуре до следующего дня.
Одновременно с опытом в совершенно одинаковых условиях ставят контроль, т. е. в отдельную пробирку наливают 1 мл физиологического раствора (без сыворотки), к которому добавляют 1—2 капли той же бактериальной взвеси, чтобы убедиться в том, что данная культура сама по себе не выпадает из взвеси в виде комочков (неспецифическое явление — самопроизвольная агглютинация).
Положительный результат реакции агглютинации характеризуется большей или меньшей прозрачностью жидкости и осадком микробов на дне пробирки. При отрицательном результате жидкость сохраняет первоначальный гомогенный вид.
Характер агглютинации, т. е. тип образующегося агглютината, может быть разнообразным. Образование крупных хлопьев, оседающих на дно пробирки, характерно для крупнохлопчатой (Н) агглютинации, наступающей в результате склеивания бактериальных клеток посредством жгутиков, и происходит в течение 2 часов пребывания пробирки в термостате.
О-агглютинины обусловливают склеивание микробвых тел, дающее компактный мелкозернистый осадок, выстилающий дно пробирки. Мелкозернистая (О)-агглютинация протекает медленнее и учитывается через 24 часа (после 2-часового пребывания в термостате и 18—20-часового выдерживания при комнатной температуре) .
Учет результатов производится невооруженным глазом при чтении крупнохлопчатой Н-агглютинации и с помощью лупы или агглютиноскопа при выявлении мелкозернистой О-агглютинации. Степень положительной реакции обозначается по четырехкрестной системе:
а)    (++ + + )— жидкость в пробирках прозрачна, очень большой осадок в виде зонтика — полная агглютинация-
б)    (+ + +) — жидкость почти прозрачна, осадок значительный — почти полная агглютинация-
в)    (++)— жидкость непрозрачная, осадок небольшой — слабая агглютинация-
г)    (+)— жидкость непрозрачная, осадок незначительный, едва заметный невооруженным глазом- при взбалтывании можно увидеть хлопья или зернистость в лупу или агглютиноскоп — отмечаются следы агглютинации.
Реакция агглютинации используется при диагностике брюшного тифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта) и других заболеваниях.
Определение вида микроба методом агглютинации. Реакция агглютинации дает возможность также определить природу неизвестного микроба и тем самым поставить диагноз. В этом случае чистая культура микроба, подлежащая определению, подвергается параллельному исследованию различными агглютинирующими диагностическими сыворотками. Для постановки реакции агглютинации при определении неизвестного микроба требуется набор агглютинирующих сывороток разных видов. Запас сывороток всегда должен иметься в лаборатории. Такие сыворотки приготовляются бактериологическими институтами. Сыворотки выпускаются в высушенном виде с соответствующими обозначениями на этикетках (название, титр, срок годности).
Получают иммунные агглютинирующие сыворотки посредством иммунизации животных (кролики, лошади). Для иммунизации выбирают типичные в антигенном отношении хорошо агглютинирующиеся штаммы соответствующего микроба.
Для идентификации микроорганизмов, имеющих несколько серологических типов, готовят типоспецифические (монорецепторные) сыворотки. Для этого из видовых сывороток извлекают групповые антитела, насыщая их последовательно родственными микробами, которые адсорбируют неспецифические агглютинины. При работе с такими сыворотками можно ограничиться только реакцией агглютинации на предметном стекле, не прибегая к развернутой, линейной агглютинации в пробирках.
Техника постановки развернутой реакции агглютинации при определении вида микроба заключается в следующем. В штатив устанавливают 10 пробирок (табл. 1), 9-я пробирка служит контролем сыворотки, 10-я — контролем антигена. Для реакции необходимы следующие ингредиенты: 1) агглютинирующая диагностическая сыворотка- 2) физиологический раствор поваренной соли- 3) антиген — микроб, выделенный из материала больного человека (кровь, кал, моча и т. д.).
Суточную или 20-часовую изучаемую культуру на скошенном агаре смывают 5 мл стерильного физиологического раствора и полученную взвесь микробов переносят в чистую пробирку. Реакция ставится в объеме 1 мл.

                    
Таблица 1
Схема постановки развернутой реакции агглютинации с целью определения вида микроба (титр агглютинирующем
сыворотки 1 : 12 800)
Пробирка

Приготовляется ряд разведений сыворотки. Как видно из схемы, физиологический раствор наливают во все пробирки, кроме 1-й и 9-й, сыворотку, разведенную  1 :100 (0,1 мл сыворотки+9,9 мл физиологического, раствора), наливают только в 1-ю, 2-ю и 9-ю пробирки.
Содержимое второй пробирки хорошо смешивают и 1 мл переносят в 3-ю пробирку, из 3-й 1 мл переносят в 4-ю и т. д., а из 8-й 1 мл удаляют.
Таким образом получают различные разведения сыворотки от 1: 100 до 1 : 12800. В каждую пробирку, за исключением 9-й контрольной, вносят по 1—2 капли микробной взвеси.
Пробирки хорошо встряхивают и ставят на 2 часа в термостат, после чего производят предварительный учет. Затем пробирки оставляют еще на 18—20 часов при комнатной температуре для окончательного учета. Интенсивность реакции обозначается знаком (+), как и при постановке реакции агглютинации с сывороткой больного.
Агглютинацию можно считать специфической только в том случае, если контроль совершенно безупречен, т. е. если в отсутствие соответствующей сыворотки склеивания микробов не происходит. Контроль сыворотки ставят для исключения возможности образования хлопьев из самой сыворотки. При оценке результатов агглютинации большое значение имеет степень разведения сыворотки, которая еще дает положительный результат, а также скорость реакции, ,т. е. время, истекшее от начала опыта до появления хлопьев. Принадлежность микроба к тому или иному виду можно считать в том случае, если он агглютинируется специфической сывороткой, разведенной до титра или до половины титра.
Ориентировочная реакция агглютинации. При бактериологической диагностике брюшного тифа, дизентерии, холеры и других заболеваний прибегают к постановке ориентировочной агглютинации. Для этого на предметное стекло наносят пастеровской пипеткой каплю агглютинирующей сыворотки в разведении 1: 10 или 1 :20 и рядом — каплю физиологического раствора для контроля. Затем к каждой капле петлей добавляют небольшое количество культуры микроба и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси бактерий. Через несколько минут в капле с сывороткой появится заметное скучивание бактерий, ускоряющееся при покачивании стекла. Контрольная капля остается равномерно мутной (рис. 56).

Рис. 56. Агглютинация на стекле.
Ориентировочной агглютинацией пользуются для определения вида микроба при выделении чистой культуры на средах в чашках Гейденрейха—Петри. Для агглютинации используется колония, из которой сделан пересев на косой агар, для постановки на следующий день развернутой (линейной) агглютинации. Таким образом, ориентировочной агглютинацией можно ускорить постановку диагноза, который затем подтверждается макроскопической агглютинацией в пробирках,