Возбудитель туберкулеза - микробиология с техникой микробиологических исследований
Микобактерия туберкулеза была открыта Кохом в 1882 г.
Морфология и тинкториальные свойства. Тонкие, часто изогнутые палочки, имеющие длину от 1,5 до 4 мк и толщину от 0,3 до 0,4 мк. Склонны к полиморфизму. В окрашенных препаратах представляются то в виде тонких, прямых или слегка изогнутых палочек, то зернистыми или в виде цепочек, состоящих из зерен (рис. 87 на вклейке).
Рис. 87. Туберкулезные бактерии в мокроте при окраске по Цилю — Нильсену.
Рис. 89. Микобактерии туберкулеза. Рост на картофельной среде.
Видео: Сбор мокроты
Они могут быть в виде длинных нитей, иногда с булавовидным вздутием на концах. Неподвижны, спор и капсул не образуют. Туберкулезные микобактерии грамположительны. Диагностической окраской для них является метод Циля — Нильсена. При этом методе красная туберкулезная микобактерия выделяется на синем фоне (см. технику окраски, стр. 49).Помимо кислотоустойчивых, встречаются и некислотоупорные формы туберкулезных микобактерий. Особенно следует отметить кислотоподатливые грамположительные зерна Муха, свободно лежащие в виде небольших групп или заключенные в телах бактерий.
У туберкулезной микобактерии описаны невидимые формы, фильтрующиеся через бактериальные фильтры. При введении животным эти формы переходят в типичные кислотоустойчивые.
Культуральные свойства. Туберкулезные микобактерии — аэробы, температурный оптимум 37°. Рост на питательных средах медленный. Едва заметный рост наблюдается с 8—10-го дня и достигает полного развития через 3—4 недели. Палочка лучше всего растет на средах с прибавлением глицерина и на яичных средах (Петрова, Петраньяни и др.). Колонии на глицериновом агаре имеют вид сухих беловатых колоний. Постепенно колонии разрастаются, сливаются и образуется сухой морщинистый налет, окрашенный в слабо желтый цвет.
Рис. 88. Микобактерии туберкулеза. Рост на картофельной среде.
На глицериновом бульоне туберкулезные микобактерии растут на поверхности в виде сухой ломкой пленки, на картофеле — в виде бородавчатых образований сероватого цвета (рис. 88). Более обильный и быстрый рост достигается на яичных средах. Наиболее распространенными питательными средами для культивирования туберкулезных микобактерий являются следующие.
Глицериновый бульон и агар. Эти среды готовят из обычного бульона и агара с добавлением 4—5% глицерина.
Свернутая яичная среда. Свежие яйца очищают, промывают водой, а затем спиртом. Желток помещают в стерильную посуду, куда добавляют физиологический раствор в следующих соотношениях: 60% желтка и 40% физиологического раствора. После смешивания разливают в стерильные пробирки и свертывают в скошенном положении в аппарате Коха в течение 2 дней (1-й день при 72° в течение получаса, 2-й день при 72° в течение 1 часа). Проверяют среду на стерильность. При засеве ватные пробки следует парафинировать для защиты среды от высыхания.
Среда Петрова. Для приготовления среды необходимо подготовить в асептических условиях следующее:
- 250 г желатины измельчают в стерильной мясорубке и добавляют 212 мл дистиллированной воды и 37,5 мл глицерина. Смесь помещают в ледник на ночь, после чего фильтруют через стерильную марлю.
- Свежие яйца (15—20 шт.) тщательно моют водой со щеткой и помещают на 15 минут в 70° спирт для дезинфекции. Затем в асептических условиях смешивают желток с белком.
- Спиртовой 1% раствор генцианвиолета.
При приготовлении среды указанные ингредиенты смешивают в следующих пропорциях: первого 200 мл, второго 400 мл и третьего 0,5—1 мл. Среду разливают в пробирки или чашки и 3 дня подряд
свертывают в аппарате Коха по 30 минут: в 1-й день до 85°, во 2-й и 3-й до 75°. Среда фиолетового цвета, колонии туберкулезных бактерий желтоватые. Если нужно сохранить культуру в лабораторных условиях, среду готовят без добавления краски.
Среда Петраньяни. К 150 мл молока прибавляют 6 г картофельного крахмала и 1 г пептона и нагревают, все время помешивая, на водяной бане до растворения, затем добавляют одну мелко нарезанную картофелину (величиной с куриное яйцо) и кипятят до образования клейстера, после чего еще один час подогревают на слабом огне. По охлаждении до 50° добавляют смесь из 2 цельных яиц, 1 желтка, 12 мл глицерина и 10 мл 2% водного раствора малахитовой зелени, хорошо взбалтывают, фильтруют через марлю, разливают по пробиркам, скашивают и дробно стерилизуют 1-й день 20 минут при 80°, 2-й и 3-й день—15 минут при 75°. Приготовленная среда имеет равномерную зеленоватую окраску с достаточным количеством конденсационной воды. Колонии туберкулезных бактерий четко выделяются на зеленом фоне среды. Рост бактерий наступает на 10—30-й день.
Глицериновый картофель по Павловскому. Картофель промывают в воде, очищают и кладут в 1 % раствор сулемы на 30 минут, промывают 12 часов в проточной воде. Ножом или пробойником для пробок делают из картофеля цилиндры, разделяя их по диагонали. Косо срезанный картофель помещают в широкую пробирку с перетяжкой внизу или накалывают на спичку так, чтобы картофель не прикасался ко дну пробирки. На дно пробирки наливают 1 мл 5% раствора глицерина. По возможности быстро стерилизуют.
Резистентность. Туберкулезные микобактерии более устойчивы, чем все другие неспороносные бактерии. Они хорошо выдерживают высушивание. Прямой солнечный свет убивает их через 45—50 минут, рассеянный — через 8—10 суток. При нагревании в жидкостях они погибают при 60° через 15 минут, а при 70° — через 3 минуты.
Из дезинфицирующих средств для обеззараживания выделений больных при туберкулезе могут быть использованы хлорная известь и хлорамин. Хлорную известь в сухом виде применяют для дезинфекции жидких субстратов (мокрота, моча, кал). Хлорно-известковое молоко употребляют в виде 10 и 20% взвеси хлорной извести в воде, осветленный раствор хлорной извести — в виде 1 и 3% раствора, хлорамин употребляют в 3 и 5% растворах. Предметы, содержащие туберкулезные палочки, опускают на 2—3 часа в 3% раствор хлорамина.
Типы туберкулезных микобактерий. Различают три типа туберкулезных микобактерий: человеческий тип (typus humanus), бычий тип (typus bovinus) и птичий тип (typus avium). Эти разновидности близки между Собой, но отличаются друг от друга рядом особенностей.
В патологии человека основная роль принадлежит туберкулезной микобактерии человеческого и бычьего типа.
Существует ряд признаков, позволяющих отличить возбудителя человеческого туберкулеза от возбудителя бычьего туберкулеза. Микобактерия туберкулеза человеческого типа длиннее и тоньше палочки бычьего туберкулеза. На искусственных питательных средах возбудитель бычьего туберкулеза растет значительно медленнее и дает более скудный рост, не нуждается в глицерине. Человеческий тип туберкулезной палочки патогенен главным образом для морской свинки, к типу бычьему чувствительны многие млекопитающие (крупный рогатый скот, морские свинки, кролики, козы, собаки и др.).
Патогенез и клиника туберкулеза. Источником инфекции являются больные люди, животные (крупный и мелкий рогатый скот) и птицы. Туберкулезные палочки выделяются от больных с мокротой (при легочной форме заболевания), с испражнениями (при кишечной форме) и с мочой (при поражении мочевых путей). Заражение туберкулезом чаще всего происходит воздушно-капельным путем. Микобактерии туберкулеза могут попасть в легкие с пылью, в кишечник с молоком от больных коров. Возможно заражение прямым и непрямым контактом, через кожу и слизистые оболочки.
При заражении туберкулезом в организме развиваются характерные патологоанатомические образования, так называемые бугорки (tuberculum— бугорок). Отсюда и возникло название процесса — туберкулез, или бугорчатка. Образование бугорков есть проявление фагоцитарной реакции организма на фосфатиды, содержащиеся в теле туберкулезной микобактерии. В центре бугорка находятся туберкулезные палочки, часто заключенные внутри гигантских клеток. При благоприятном лечении бугорок уплотняется, пропитывается солями извести, и наступает его петрификация (окаменение). Туберкулезные микобактерии долгие годы остаются жизнеспособными внутри бугорков, поддерживая постоянную возможность обострения туберкулезного процесса при ослаблении организма.
Клинические проявления туберкулеза разнообразны. Это связано с местом поражения, вирулентностью микроба и устойчивостью макроорганизма. У людей чаще всего бывает легочная, форма туберкулеза, но туберкулезом
может поражаться любая ткань (костная ткань, почки, суставы, глаза и т. д.).
Туберкулез обычно протекает как хроническое заболевание, но в случаях проникновения из первичного очага в кровь большого количества туберкулезных микобактерий он принимает острую милиарную форму.
Симптомы туберкулеза (лихорадка, похудание и т. п.) обусловливаются тем, что в организм из туберкулезных очагов попадают ядовитые продукты, вырабатываемые туберкулезными бактериями.
Туберкулин. Туберкулезные палочки содержат белковое вещество — туберкулин, который впервые был получен Кохом. Существует несколько препаратов туберкулина. Старый коховский туберкулин (альттуберкулин)— прозрачная, темно-коричневого цвета жидкость — представляет собой фильтрат убитой стерилизацией 6—8-недельной культуры туберкулезных микобактерий на глицериновом бульоне и выпаренной до 110 объема на водяной бане. Фильтрат содержит продукты жизнедеятельности и экстрактивные вещества возбудителя туберкулеза. В отличие от микробных токсинов туберкулин оказывает ядовитое действие только на организм туберкулезного больного и не действует на здоровый. Туберкулин широко применяют для диагностики туберкулеза при помощи реакций Пирке и Манту (аллергические реакции). Воднорастворимые белки туберкулезных бактерий являются аллергенами и вызывают состояние аллергии.
Проба Пирке. На обработанную эфиром или бензином кожу предплечья наносят три поверхностные скарификации (специальным борчиком или ланцетом). При этом следует избегать появления крови. На две из них наносят по капле туберкулина, на третью (контрольную) — каплю 0,5% раствора фенола. При положительной реакции там, где нанесен туберкулин, через 12—24— 48 часов появляется папула с гиперемическим венчиком. Контрольная скарификация при правильной технике не обнаруживает реактивных явлений.
Реакция Манту. Эту реакцию ставят, вводя строго внутрикожно 0,1 мл разведенного 1 : 1000 туберкулина. Реакцию лучше всего проводить на предплечье. Кожу фиксируют снизу левой рукой и иглу шприца вводят
в толщу кожи параллельно поверхности. Учет реакции производят через 48 часов. Появление на месте укола папулы не менее 10 мм в диаметре указывает на положительный результат.
В последнее время для этих реакций применяют очищенный белковый препарат (PPD).
Иммунитет. Человеческий организм обладает известной степенью врожденной невосприимчивости к туберкулезу. Об этом свидетельствуют клинические наблюдения, согласно которым туберкулезное инфицирование в ранние годы заканчивается выздоровлением среди значительных масс населения. В основе иммунитета при туберкулезе лежат изменения клеточной реакции организма.
Туберкулезные микобактерии очень долго остаются жизнеспособными в очагах (бугорках), что приводит к так называемому «нестерильному», или «инфекционному», иммунитету.
Однако некоторая часть взрослого населения остается свободной от ранней туберкулезной инфекции. У этих лиц могут возникнуть первичные формы туберкулезного заболевания, особенно при ухудшении материально-бытовых условий. Поэтому специфическая профилактика туберкулеза имеет значение не только для детей, но и для взрослых. В сыворотке туберкулезных больных обнаружены агглютинины, преципитины, лизины и комплементсвязывающие антитела.
Однако эти антитела в механизме противотуберкулезного иммунитета роли не играют.
Микробиологическая диагностика. Микробиологический диагноз ставится для распознавания туберкулезного заболевания у человека и животных, для нахождения туберкулезного микроба в пищевых продуктах (например, в молоке, сыре) и в окружающей среде (например, в пыли). Лабораторному исследованию подвергаются мокрота, гной, моча, спинномозговая жидкость, кал и т. д. Кроме того, для исследования на наличие туберкулезных микобактерий у больных берут промывные воды желудка и бронхов, слизь из гортани (слизь снимают специальным тампоном).
Исследование мокроты на туберкулезные палочки производится путем бактериоскопии мазков, получением чистых культур и заражением подопытных животных. Из мокроты приготовляют препарат и окрашивают его по Цилю—Нильсену. При этом на синем фоне видны по
лиморфные рубиново-красные микобактерии. Необнаружение палочек туберкулеза при тщательном осмотре всего окрашенного препарата не исключает возможности наличия их в исследуемой мокроте. В таких случаях прибегают к методу накопления.
Способ этот заключается в следующем. Мокроту смешивают с равным или двойным объемом антиформина (смесь раствора Natrii hypochlorosi и NaOH) и энергично встряхивают, а затем оставляют на 15—30 минут до полной гомогенизации. При этом все клеточные элементы и посторонние микробы растворяются, а туберкулезные бактерии благодаря их щелочеустойчивости сохраняются. Гомогенизированную мокроту центрифугируют, осадок нейтрализуют 30% раствором уксусной кислоты и из него готовят мазки, которые, как обычно, окрашивают по Цилю—Нильсену.
В практику вошел метод флотации. Мокроту собирают в течение 2—3 дней и к ней добавляют равный объем 0,5% NaOH и встряхивают 5 минут. Эту смесь подогревают полчаса при 58° на водяной бане и со дна отсасывают грубые примеси пипеткой, затем добавляют 0,5-г-1 мл ксилола и доливают до 200 мл дистиллированной воды. Всю эту смесь встряхивают, отстаивают 15— 30 минут, причем образуется верхний кольцеобразный беловатый пенистый слой, который отсасывают постепенно пастеровской пипеткой и переносят на предметное стекло. Из этого материала приготовляют мазок. Последний подсушивают при 60—65°, обезжиривают эфиром, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым фуксином с последующим обесцвечиванием 3% солянокислым алкоголем и докрашиванием пикриновой кислотой или метиленовой синью.
В случае отрицательного результата бактериоскопии прибегают к бактериологическому, методу, который в настоящее время стал осуществимым.
Перед посевом мокроту обрабатывают следующим образом. Мокроту смешивают с двойным объемом 6% раствора серной кислоты, убивающей всех бактерий, кроме кислотоустойчивых, затем посредством центрифугирования собирают осадок и 3 раза отмывают от серной кислоты центрифугированием со стерильным физиологическим раствором. Отмытый осадок вносят пипеткой в 5—8 пробирок с питательной средой и хорошо втирают петлей в поверхность среды. Посев выдерживают
в термостате 6—8 недель. Для предохранения от высыхания пробирки герметически закрывают при помощи парафина: ватную пробку предварительно снаружи обрезают, продвигают в глубь пробирки и с помощью пастеровской пипетки с резиновым баллончиком заливают расплавленным парафином.
Предложено несколько методов для ускорения бактериологической диагностики туберкулеза. По Прайсу, туберкулезные микобактерии выращиваются на препаратах-мазках. На предметных стеклах готовят мазки из исследуемого материала, препараты погружают стерильным пинцетом на 5 минут в 10% раствор серной кислоты, затем промывают погружением в стерильный физиологический раствор и опускают во флаконы с питательной средой (1 часть стерильной крови+ 3 части дистиллированной воды). Через 7—10 дней препараты окрашивают по способу Циля—Нильсена и под микроскопом обнаруживают микроколонии — скопления туберкулезных микобактерий (рис. 89) в виде жгутов.
Е. А. Школьникова разработала метод глубинного посева на кровяную сыворотку. Сущность его заключается в следующем. Патологический материал (мокрота, вязкий гной) обрабатывают 8—10—12% раствором серной кислоты и центрифугируют. Осадок двукратно промывают (с центрифугированием) стерильной дистиллированной водой и засевают петлей в 3 пробирки с 5 мл специальной среды (цитратная кровь человека, кролика или барана, перед посевом разведенная дистиллированной водой 1 2, 1 3). Посев делают в глубину кровяной среды. Пробирки парафинируют и ставят в термостат при 37—38° на 7—10, а в случае задержки роста на 15—20 дней. После этого содержимое пробирки (каждую пробирку по времени исследуют отдельно) центрифугируют и осадок однократно промывают дистиллированной водой. Из осадка делают мазки, окрашивают по Цилю—Нильсену и рассматривают под микроскопом.
Если материал, подлежащий исследованию, не содержит посторонней микрофлоры (спинномозговая жидкость, серозный экссудат и т. д.), то его сразу, без предварительной обработки серной кислотой, засевают на кровяную среду.
Кроме указанных методов, применяют и биологическое исследование мокроты. Для этого около 1 мл мокроты вводят морской свинке, лучше всего под кожу в области пахового сгиба. Животные могут преждевременно погибнуть, если в мокроте находятся вирулентные стрептококки или пневмококки. Поэтому мокроту обрабатывают следующим образом. Тщательно встряхивают ее в стерильной баночке с бусами, добавив 2—5 мл физиологического раствора, и подогревают на водяной бане при 58° (не выше 60°) в течение 5—8 минут. Обработку производят серной кислотой, так же как и для посева, с троекратным промыванием стерильным физиологическим раствором. После такой обработки осадок взбалтывают в небольшом объеме физиологического раствора и вводят морским свинкам под кожу в области пахового сгиба или в мышцы бедра задней лапки. Уже через 3 недели после введения регионарные железы значительно увеличиваются. В это время можно вылущить одну из желез и подвергнуть исследованию на присутствие туберкулезных бактерий в мазках и на срезах. Можно также путем пунктирования таких желез и бактериоскопии пунктата обнаружить туберкулезные палочки.
Морские свинки должны находиться под наблюдением не менее 3 месяцев, после чего их убивают для патологоанатомического исследования. В положительных случаях обнаруживается милиарный туберкулез.
При исследовании мочи на туберкулезные бактерии во избежание попадания палочек смегмы мочу берут стерильно (катетером) после тщательного обмывания наружного отверстия уретры. Для бактериоскопического исследования требуется суточная порция мочи, для бактериологического — утренняя. Осадок, полученный центрифугированием, исследуют обычным способом. Для отличия от посторонних кислотоустойчивых бактерий следует произвести посев и поставить биологическую пробу.
Исследование спинномозговой жидкости проводится следующим образом: пробирку со свежеполученным прозрачным и бесцветным ликвором отстаивают в леднике около 24 часов. В случае образования за это время тонкой и нежной пленки (так называемой паутинки) жидкость осторожно и медленно выливают на предметное стекло, косо поставленное в стеклянную чашку. «Паутинку» надо задержать платиновой иглой и не дать ей сползти со стекла с током жидкости.
Распределённую по стеклу пленочку высушивают в термостате, фиксируют (лучше спиртом с эфиром), окрашивают по Цилю—Нильсену и микроскопируют. Если бактериоскопически туберкулезные микобактерии обнаружены не будут, необходимо поставить опыт с заражением морских свинок.
Специфическая профилактика туберкулеза осуществляется иммунизацией детской группы населения вакциной БЦЖ (BCG сокращенное Bacille Calmette Guerin). Эта вакцина получена Кальметтом и Гереном, которые в течение 13 лет выращивали возбудителя бычьего туберкулеза на глицериновом картофеле с прибавлением желчи. В результате этого культура настолько утратила свою вирулентность, что представляется безвредной для животных даже в больших дозах. Приживаясь в организме, такие туберкулезные микобактерии создают безвредные очаги и тем самым нестерильный иммунитет при туберкулезе.
Общие меры борьбы с туберкулезом. Туберкулез и сифилис относятся к инфекционным заболеваниям, которые носят ясно выраженный социальный характер. В капиталистическом обществе, в котором классовая принадлежность определяет жизненную обеспеченность, для пролетариата создаются условия, способствующие заболеваемости туберкулезом.
Основные мероприятия в борьбе с туберкулезом в нашей стране сводятся к оздоровлению труда и быта и к профилактике, базирующейся на раннем распознавании туберкулеза, выявлении бактериовыделителей, широкой диспансеризации, санаторно-курортном лечении и активной иммунизации.
Лечение туберкулеза с успехом производится применением стрептомицина, ПАСК, фтивазида, тибона и туберкулостатических препаратов, действующих на микобактерии, устойчивые к этим основным препаратам,— циклосерина, канамицина, рифампицина и др.
