Окраска - микробиология с техникой микробиологических исследований
Для окрашивания бактерий необходимо иметь ряд красящих растворов, желательно в особых склянках с пипетками, на которые надеты резиновые баллончики. Краску при помощи пипетки наливают на препарат так, чтобы весь мазок был покрыт ею. Препарат с краской помещают на подставку для предметных стекол. Такую подставку кладут на чашку или фотографическую ванночку (рис. 14). Если при окрашивании необходимо подогревание, то пользуются специальным пинцетом для предметных стекол (рис. 15). По окончании окрашивания краску смывают струей воды или препарат промывают в сосуде с водой. После промывания препарат оставляют в вертикальном положении для просушивания или сушат между листками фильтровальной бумаги. Если на препарате останется вода, то, соединившись с иммерсионным маслом, она даст эмульсию, мешающую хорошему видению при микроскопии.
Краски
Краски, применяемые для бактериологических исследований, относятся к группе так называемых анилиновых. Но поскольку они получаются не только из анилина, но и из других производных каменноугольного дегтя — бензола, толуола и др., то правильнее называть их каменноугольными красками. Краски эти разделяются на основные и кислые. Термины «кислые» и «основные» только определяют сродство краски к определенной части клетки. Основными красками хорошо окрашиваются ядра и микробы. Кислые краски окрашивают микробов слабее, при окраске же тканей они окрашивают цитоплазму клеток. Наиболее употребительны следующие краски: метиленовый синий, тионин (синие краски), основной фуксин, сафранин и эозин (красные краски), бисмаркбраун, или везувин (коричневая краска), метилгрюн (зеленая краска), метилвиолет, генцианвиолет (фиолетовые краски). Из них только эозин — кислая краска. Она употребляется для некоторых специальных целей.
Все эти краски продаются в виде аморфных или кристаллических порошков, и из них уже готовят красящие растворы.
Приготовление красящих растворов. Исходным материалом почти для всех необходимых рабочих красок являются насыщенные спиртовые растворы, которые следует иметь в запасе и сохранять в склянках с притертыми пробками. Насыщенные спиртовые растворы готовят следующим образом: 10 г сухой краски высыпают во флакон с притертой пробкой, наливают 100 мл 96° спирта (ректификата) и дают настояться в течение нескольких дней, каждый день взбалтывая раствор. Из таких насыщенных растворов готовят спирто-водные пастворы, пригодные для окраски микробов. Наиболее часто употребляются следующие растворы.
Карболовый фуксин (фуксин Циля)
10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина 100 мл 5% карболовой кислоты
Разведенный фуксин
10 мл карболового фуксина 90 мл дистиллированной воды
Щелочный метиленовый синий 30 мл насыщенного спиртового раствора синей 100 мл дистиллированной воды 1 мл 1% раствора щелочи
Карболовый генцианвиолет 10 мл насыщенного спиртового раствора генциаивиолета 90 мл 5% карболовой кислоты
Растворы генциаивиолета дают осадки при окрашивании. Вместо генциаивиолета можно пользоваться насыщенными спиртовыми растворами метилвиолета или кристалвиолета. Растворы карболовой кислоты можно брать 1%, а не 5%. Кроме того, для окраски по Граму можно пользоваться 0,25% водным раствором метилвиолета или кристалвиолета без карболовой кислоты. Раствор стоек и осадка не дает.
По методу Синева вместо раствора генцианвиолета применяют кусочки фильтровальной бумаги, предварительно пропитанные спиртовым раствором краски и затем высушенные. Для этого листы фильтровальной бумаги погружают на 1—2 минуты в 1—2% раствор краски в 96° спирту, после чего бумагу высушивают на протянутой веревочке или стеклянных палочках и разрезают на кусочки 2X4 см. Такие бумажки сохраняются в банках с притертой пробкой неограниченное время.
Простые методы окраски микробов. В лабораторной технике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Простым методом окраски называют окраску препарата одной какой-либо краской. К таким методам относится окраска разведенным фуксином или щелочной метиленовой синей.
Окраска разведенным фуксином. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на пламени горелки. Затем на охлажденный препарат на 1—2 минут наливают разведенный фуксин. Краску смывают водой и препарат высушивают.
Окраска щелочным метиленовым синим (Леффлера). На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на огне. На остывший мазок наливают метиленовую синь на 2—3 минуты. Краску смывают водой и препарат высушивают. При окраске дифференцируется ядро и цитоплазма, и поэтому при окраске патологического материала (гной, экссудат и т. д.) целесообразнее использовать метиленовый синий.
Сложные методы окраски микробов. При сложных методах окраски микробов на один и тот же препарат воздействуют несколькими растворами красителей. Сложные методы основаны на физико-химическом строении бактериальной клетки и сродстве микробов к определенным краскам. Эти методы окраски имеют важное значение при дифференциации микробов. К сложным методам относится окраска по Граму, Цилю — Нильсену, Нейссеру и т. д.
Окраска микробов по методу Грама. Все микробы по их отношению к окраске по методу Грама делятся на две группы: а) грампозитивные, или грамположительные- б) грамнегативные, или грамотрицательные.
Различное отношение к окраске по Граму зависит от отличий в физическом и химическом строении самих бактерий. Для окраски по классическому методу Грама необходимы следующие растворы:
- карболовый генцианвиолет;
- раствор Люголя (йода кристаллического 1 г, йодистого калия 2 г и дистиллированной воды 300 мл- йод и йодистый калий смешивают и растворяют в 5 мл воды, а затем добавляют остальную воду);
- спирт 96°;
- разведенный фуксин.
Техника окраски по Граму. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу, по размеру равную сделанному мазку. На эту бумагу наливают раствор генцианвиолета на I—2 минуты. Сливают краску с бумагой и, не промывая препарат водой, наливают на 1— 2 минуты раствор Люголя до почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на 1/3—1 минуту наливают 96° спирт (при этом препарат надо покачивать). Промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты). Сливают краску, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Видоизмененный способ Грама (по А. Синеву). l.Ha фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную 1% спиртовым раствором кристалвиолета или генцианвиолета.
- Наносят на бумагу 2—3 капли воды и оставляют на 2 минуты.
- Снимают бумагу пинцетом и наливают раствор Люголя на 1—2 минуты.
- Обесцвечивают спиртом (10—30 секунд).
- Дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты). _
Механизм окраски по Граму. Сущность метода Грама состоит в том, что краска генциан-, метил- или кристалвиолет обладает способностью прочно фиксироваться в бактериальной клетке. В этом случае под действием спирта не наступает обесцвечивание, микроб остается окрашенным в фиолетовый цвет. Это значит, что он грамположительный. Если же в бактериальной клетке краска не будет фиксирована, то под действием спирта микробы обесцвечиваются и воспринимают дополнительную краску — разведенный фуксин. Микробы окрашиваются в розовый цвет, т. е. они будут грамотрицательны (рис. 16 на вклейке).
Окраска кислотоустойчивых микробов. Способы окраски кислотоустойчивых микробов основаны на их способности окрашиваться лишь сильно красящими растворами красок при нагревании. При последующем действии слабых кислот они не обесцвечиваются. Благодаря такой обработке кислотоустойчивые микробы могут быть дифференцированы от других бактерий. Наиболее употребительна окраска по Цилю — Нильсену.
Техника окраски. 1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на которую наносят карболовый фуксин, и препарат окрашивают при нагревании до троекратного появления паров, после чего оставляют краску еще на несколько минут и дают препарату остыть.
Рис. 16. Окраска по Граму стафилококка и вибриона.
- Сливают краску и промывают препарат водой. ,3- Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (10—30 секунд).
- Промывают водой.
- Промывают чистым спиртом 10—15 секунд.
6. Спирт смывают водой.
7. Докрашивают синью Леффлера в течение 3—5 минут.
Обесцвечивание препарата можно также произвести 3% раствором солянокислого спирта. При этом методе окраски кислотоустойчивые туберкулезные бактерии окрашиваются в рубиново-красный цвет, а другие, некислотоустойчивые микробы, — в синий цвет (см. рис. 88 на вклейке).
Кислото- и спиртоустойчивость туберкулезных микобактерий объясняется тем, что они имеют в своем составе миколовую кислоту, вступающую в химическое соединение с карболовым фуксином. Это соединение фиксирует краску в микробной клетке, и поэтому палочки не обесцвечиваются.
Окраска спор. В микробиологической практике применяют несколько методов окраски спор (рис. 17 на вклейке).
- Способ Пешкова. На краю предметного стекла делают тонкий мазок из культуры бактерий, просушивают на воздухе и фиксируют спирт-эфиром, спирт- формалином или па пламени горелки. На фиксированный препарат наливают синь Леффлера и на пламени горелки доводят до кипения в течение 15—20 секунд. Дают препарату остыть, промывают водой и докрашивают 0,5% водным раствором нейтральрота 30—60 секунд. Краску промывают и препарат высушивают. Споры окрашиваются в голубой или синий цвет, вегетативные формы — в розовый.
- Способ Гансена. Препарат фиксируют на пламени горелки 5—7 раз, на фиксированный препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, на которую наносят карболовый фуксин, и на пламени горелки доводят до кипения. Препарату дают слегка остыть, доливают карболовый фуксин и снова кипятят. Затем, долив карболовый фуксин, кипятят третий раз. Препарату дают остыть, промывают водой, обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 20—30 секунд и докрашивают синью в течение 3—5 минут. Споры, стойко прокрасившиеся фуксином, — красные, а вегетативные тела бактерий, обесцветившиеся в результате воздействия серной кислоты, окрашиваются метиленовым синим в синий цвет (см. рис. 101 на вклейке).
Рис. 18. Капсулы у пневмококка. 
Рис. 17. Споры бацилл.
Рис. 19. Капсулы у бактерий.
Окраска капсул. Окраска капсул удается с помощью обычных красок, метиленовой синей или разведенным фуксином, причем лучше всего в мазках из органов или тканевой жидкости (рис. 18 на вклейке). В этих случаях тела микробов и фон (клетки органа) окрашены в синий или красный цвет, капсула же видна как бесцветная каемка, окружающая микроб.
Метод Гинса. При окраске капсул в чистой культуре микробов пользуются методом Гинса.
Техника окраски. 1. На предметное стекло наносят каплю чертежной туши и разбавляют равным количеством воды.
- В полученную каплю вносят небольшое количество агаровой или бульонной культуры бактерий и смешивают петлей.
- Ребром шлифовального стекла касаются капли туши и, когда тушь растекается по ребру стекла, делают мазок, как мазок из крови.
- Мазок фиксируют в концентрированном растворе сулемы 1 минуту или на пламени горелки.
- Промывают водой (при фиксации в сулеме).
- Окрашивают карболовым фуксином или синью 5—10 минут.
- Смывают водой, сушат и микроскопируют.
Капсулы не окрашиваются, но благодаря применению туши представляются резко очерченными, тела же бактерий окрашены и лежат внутри капсулы (рис. 19, на вклейке).
Окраска метахроматических зерен (волютина) по Нейссеру. Необходимо приготовить две краски: а) уксуснокислую синь Нейссера, б) краску везувин, или бисмаркбраун.
Синь Нейссера состоит из двух растворов:
Раствор А
Метиленового синего 0,1 г Этилового спирта 2 мл Ледяной уксусной кислоты 5 мл Дистиллированной воды 100 мл
Раствор Б
Кристалвиолета 1 г
Этилового спирта (абсолютного) 10 мл Дистиллированной воды 300 мл
Растворы А и Б смешивают непосредственно перед окраской в отношении 2:1.
Краска везувин, или бисмаркбраун, получается путем растворения 1 г порошка в 300 мл кипящей дистиллированной воды.
Техника окраски. На фиксированный препарат наносят синьку Нейссера на 0,5—1 минуту, краску смывают водой и дополнительно окрашивают раствором везувина 1—3 минуты. После этого препарат промывают водой, сушат и микроскопируют. По этому способу бактерии окрашиваются в светло-коричневый цвет, а метахроматические зерна — в синий (рис. 83 на вклейке).
В некоторых лабораториях приведенный классический метод Нейссера несколько видоизменяют. Уксуснокислую синь наносят на 4—5 минут, промывают водой. Затем на препарат наливают на V2—1 минуту раствор Люголя, сливают его и докрашивают везувином в течение 1—V2 минуты.
Окраска по Романовскому—Гимзе. Краска Гимзы — смесь азура (органическая краска, получаемая из метиленового синего), эозина и метиленовой сини. Будучи в растворе синего цвета, она окрашивает клеточную цитоплазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий — в красно-фиолетовый цвет.
Окраска по Романовскому—Гимзе является одним из основных методов при изучении морфологии простейших, спирохет, а также при исследовании форменных элементов крови.
Способ применения. К 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабощелочной реакции непосредственно перед окраской препарата прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если поместить препарат с краской в термостат при 37°, то окрашивание происходит быстрее (30—40 минут). Результаты окрашивания зависят от свойств воды, поэтому следует проверять ее реакцию.
Окраска риккетсий по Здродовскому. Тонкий мазок фиксируют на пламени горелки. Окраску производят разведенным карболовым фуксином (10—15 капель фуксина на 10 мл бидистиллированной воды) в течение 5 минут. Окрашенный препарат промывают водой, а затем обесцвечивают в растворе органической или минеральной кислоты (0,5% лимонная кислота, 0,01% соляная кислота) в течение 2—3 секунд. Затем препарат промывают водой и докрашивают 0,5% раствором метиленовой сини в течение 1/3 минуты. В препарате на синем фоне будут видны окрашенные в красный цвет риккетсии (рис. 116 на вклейке).
Исследование микроорганизмов в живом состоянии
Так как методы обнаружения жгутиков трудны, а определение подвижности микробов служит целям определения их вида, то в повседневной лабораторной практике для определения подвижности пользуются наблюдением бактерий в живом состоянии — в раздавленной или висячей капле.
Раздавленная капля. На середину предметного стекла наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала. Эту каплю накрывают покровным стеклом, осторожно накладывая его пинцетом, чтобы в жидкости не образовалось пузырьков воздуха. Правильно сделанная капля заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, но при этом жидкость не выступает за края покровного стекла. Если требуется рассматривать препарат продолжительное время, то края покровного стекла предварительно смазывают вазелином.
Висячая капля. Каплю исследуемого материала наносят на середину покровного стекла. Затем покровное стекло быстро поворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло с углублением («лункой») в середине. Капля должна свободно свисать в углубление, не соприкасаясь с его дном и краями (рис. 20). Края выемки на предметном стекле следует предварительно смазать вазелином. Таким образом, капля оказывается герметически закрытой во влажной камере и защищенной от высыхания.
Определение подвижности у микробов используется при лабораторной диагностике дизентерии, холеры, брюшного тифа и других заболеваний.
При исследовании живых микробов следует отличать активную подвижность бактерий, свидетельствующую о наличии у них невидимых жгутиков, от пассивного молекулярного (броуновского) движения, свойственного всем взвешенным в жидкости мелким частицам (форменные элементы, зернышки, пылинки, микробы как лишенные жгутиков, так и убитые).
Рис. 20. Висячая капля.
Исследование в темном поле зрения. Движение бактерий и спирохет можно наблюдать в микроскопе, который отличается от обычного применением яркого бокового освещения, в силу чего получается изображение светящегося объекта на темном фоне. Принцип темного поля основан на том, что падающие сбоку световые лучи отклоняются плотными частицами (в частности, бактериями) и последние благодаря этому представляются глазу наблюдателя ярко светящимися. Боковое освещение в микроскопе можно получить, заменив обычный осветитель специальным конденсором с затемнением в центре. Такой конденсор задерживает все центральные лучи света и пропускает лишь периферические. Техника исследования заключается в следующем. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и осторожно накрывают покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха. Затем на поверхность конденсора помещают каплю воды или кедрового масла и предметное стекло с препаратом кладут на эту каплю.
