Окрашивание и заключение срезов - основы гистологии
Видео: Заключение гистологических образцов под покровное стекло.
Для того чтобы срез, приготовленный одним из указанных выше способов, можно было исследовать в микроскоп, необходимо, чтобы структурные компоненты составляющих его тканей были хорошо различимы в проходящем свете и чтобы срез был защищен от возможного загрязнения и повреждения. Поэтому дальнейшая обработка среза предусматривает его окрашивание, просветление и заключение.
Общие замечания
Несмотря на то, что окрашивание срезов имеет давнюю историю, до настоящего времени полностью неясна сущность механизмов действия многих красителей. Несомненно лишь, что в основе окрашивания тканевых микроструктур лежат физико-химические процессы. Из физических факторов в первую очередь следует отметить явления диффузии (проникновение), адсорбции (поверхностное впитывание) и абсорбции (глубокое пропитывание) красителя, а также его растворимость, из химических — электролитические свойства красящих растворов и самих тканей. Немаловажное значение имеют плотность тканей и дисперсность красителя. Первое свойство определяет последовательность окрашивания отдельных структур, второе — скорость процесса окрашивания.
Именно на электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислотные и нейтральные.
Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структуры кислой природы, например хроматин ядра, содержащий ДНК, и ядрышко, содержащее РНК. Отсюда и термин базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся основными красителями (тионин, гематоксилин, метиловый зеленый и др.).
Кислотный краситель — это красящая кислота или ее соль, в силу чего он окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эозинофильных лейкоцитов, цитоплазму некоторых клеток передней доли гипофиза и др. Отсюда и термин оксифилия (ацидофильный — любящий кислоту) для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями. В эту группу веществ входят эозин, эритрозин, кислотный фуксин, конго красный и др.
Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кислотного и основного красителей (соединение красящей кислоты с красящим основанием). К этой группе относятся судан, эозиновокислый метиленовый синий и др.
Не следует путать нейтральный краситель с нейтральной красящей смесью, для которой характерно одновременно присутствие в растворе основного и кислотного красителей. Термин же нейтрофилия применим к результатам окрашивания обеими группами красителей, так как отражает не свойство красителя, а равновесие между кислотными и основными свойствами окрашиваемых элементов.
Следует помнить, что на качество окраски и ее стойкость значительное влияние могут оказывать способ фиксации, предварительная и последующая обработка препаратов. Поэтому нужно строго соблюдать все методические указания и общие правила окрашивания.
Необходимо также подчеркнуть, что большинство гистологических красителей неспецифично, т. е. не раскрывает химическую природу тканевых компонентов. С их помощью можно изучать лишь морфологические особенности микроструктур.
Красители, применяемые для гистологических целей, делят на природные и искусственные.
Различают несколько типов гистологического окрашивания: прогрессивный, регрессивный, прямой, непрямой, простой и сложный.
Прогрессивное окрашивание — это такой способ, при котором срезы находятся в красителе до тех пор, пока не достигнут требуемого уровня окрашиваемости.
Регрессивное — срезы вначале перекрашивают, а затем доводят до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо выделить отдельные элементы тканей.
Следует постоянно помнить: а) о тщательном удалении отмывающей жидкости (в противном случае она будет продолжать действовать и исказит результат окраски)- б) о предпочтительном применении тонких срезов- в) о том, что разведенные красители дают лучшие результаты, чем крепкие растворы (толстые срезы и высокая концентрация красителя затрудняют дифференцировку и приводят к неравномерной окраске срезов)- г) о том, что окраску нужно проводить под контролем микроскопа.
Применение регрессивных методов окраски требует определенного навыка, который приобретается постепенно.
Прямое окрашивание — окрашивание объекта непосредственно в растворе красителя, непрямое (протравная) — срез окрашивают нужным красителем лишь после предварительной обработки специальными протравными красителями.
При простом окрашивании применяют один краситель. Сложное окрашивание предусматривает обработку препарата несколькими красителями (двумя и более) одновременно или последовательно (см. окраска гематоксилин-эозином, окрашивание по методу Ван-Гизона).
Все методы гистологического окрашивания можно разделить на две основные группы: а) обзорные, используемые для получения общего ориентировочного представления об изучаемом объекте (окрашиваются преимущественно ядра и цитоплазма клеток)- б) специальные, которые позволяют окрашивать именно те тканевые и клеточные элементы, которые интересуют исследователя (органеллы клетки, волокнистые структуры и т. д.). Методы, составляющие вторую группу, более сложные и требуют особых способов фиксации.
Для того чтобы получить хорошие результаты при любом методе окраски гистологических препаратов, необходимо соблюдать определенные правила.
- Красящие растворы должны быть чистыми, поэтому любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде.
Рис. 77.
Расположение биологических стаканчиков (батарея) для последовательной обработки наклеенных на стекло срезов (депарафинирование, обезвоживание).
- Отдавать предпочтение: а) окрашиванию красителями низкой концентрации в течение длительного времени перед кратковременной окраской красителями высокой концентрации- б) применению регрессивных методов.
- Тщательно выполнять все процедуры при подготовке среза к окраске и последующей его обработке.
Техника окрашивания
Предварительная подготовка. Перед тем как приступить к окрашиванию срезов, их, как правило, подвергают специальной предварительной обработке, характер которой зависит от методов фиксации материала и приготовления срезов.
Парафиновые срезы требуют наиболее сложной подготовки. Так как парафин не обладает достаточной прозрачностью и затрудняет процесс окрашивания (гистологические красители — это водные или спиртовые растворы, плохо проникающие в парафинированные ткани), его необходимо удалить из среза. Для этого срез подвергают депарафинированию — процессу, обратному тому, который осуществляют при подготовке объекта к заливке в парафин, т. е. срезы последовательно проводят через растворитель парафина, спирты нисходящей концентрации и помещают в воду. Практически это осуществляют так.
Можно одну смену 96% спирта заменить порцией абсолютного спирта, а вместо 70% применить 80% или 60% спирт. Важно сохранить лишь принципиальную схему.
Этикетируют биологические стаканчики (или высокие бюксы), наливают в них соответствующие растворы и устанавливают в определенной последовательности (рис. 77), обеспечивающей проведение манипуляций по следующей схеме.
Примечание. В тех случаях, когда материал был фиксирован в жидкостях, содержащих дихлорид ртути, срезы необходимо подвергнуть дополнительной обработке, поместив их после 96° спирта в йодированный спирт. Время пребывания среза в растворе устанавливают опытным путем, наблюдая под микроскопом за растворением осадков дихлорида ртути. Так как йод вредно влияет на многие красители, его удаляют путем последующей обработки срезов (после 70% спирта) 0,25% раствором гипосульфата до исчезновения желтоватой окраски. Затем производят отмывание гипосульфата в дистиллированной воде.
Целлоидиновые срезы можно окрашивать без предварительного удаления целлоидина. В этих случаях срезы из 70% спирта (в котором их хранят или в который собирают в процессе резки) переносят в 50% спирт, а затем в дистиллированную воду. Если применяемый краситель окрашивает целлоидин, то последний удаляют, поместив срез в один из растворителей целлоидина (смесь из равных количеств абсолютного спирта с эфиром, ацетоном, метиловым спиртом). После растворения целлоидина срез обрабатывают так же, как при депарафинировании (спирты нисходящей концентрации — вода).
Желатиновые срезы освобождают от желатина, помещая в слегка подкисленную дистиллированную воду, подогретую до 37°С. Если блок подвергался дополнительному уплотнению в формалине, то удалить желатин невозможно, и это в ряде случаев может затруднить микроскопирование.
Замороженные срезы не нуждаются в предварительной обработке, так как обычно при резке их собирают в дистиллированную воду.
Предварительной обработке и последующей окраске можно подвергать как наклеенные на предметные стекла, так и свободно-плавающие срезы. В первом случае употребляют биологические стаканчики, специальные кюветы, высокие бюксы. Для того чтобы увеличить пропускную способность, стекла со срезами складывают попарно стороной, не несущей срез (спинкой), друг к другу и располагают в виде треугольника (рис. 78) или (в более просторном сосуде) укладывают пары друг за другом, разделяя их с помощью различных приспособлений (изогнутые стеклянные или металлические пластинки и т. д.). Для работы со свободноплавающими срезами применяют часовые стекла, низкие бюксы или чашечки. Не наклеенные срезы переносят из одной посуды в другую с помощью стеклянного (или металлического) крючка или шпателя, а стекла — пинцетом.
Рис. 78.
Расположение стекол со срезами в стаканчике.
Посуда должна быть четко этикетирована и расставлена в определенном порядке, обеспечивающем нужную последовательность работы.
Примечание. При переносе срезов из одного раствора в другой необходимо следить за тем, чтобы последующая порция жидкости как можно меньше загрязнялась предыдущей (особенно при перемещении из ксилола в спирт). Для этого при переносе предметных стекол и свободноплавающих срезов стараются обеспечить максимальное стекание жидкости, следя одновременно за тем, чтобы срез не подсох (высыхание заметно по побелению среза). Предметные стекла, сложенные попарно, необходимо разъединить и быстро просушить обратную сторону фильтровальной бумагой или тряпочкой, следя за тем, чтобы не перепутать стороны. Следует также быть внимательным при опускании и извлечении стекол со срезами, ибо при этом можно поцарапать срезы.
Необходимо своевременно менять растворы, не допуская их чрезмерного загрязнения.
Если срезы в процессе дальнейшей обработки отклеиваются от стекол (при применении ярко выраженных кислых или щелочных растворов или недостаточно прочном приклеивании), то это можно исправить, применив целлоидиновую защиту. Для этого срез из воды помещают последовательно в 70% и 96% спирт, затем стекло опускают в 0,5—1% раствор целлоидина, вынимают, дают слегка подсохнуть (не до полного высыхания!) и помещают в 70% спирт.
Рис. 79.
Приспособление для одномоментной обработки большого количества стекол со срезами.
В результате этих манипуляций срез и прилежащие участки предметного стекла покрываются тонкой целлоидиновой пленкой, благодаря которой и достигается укрепление среза и на стекле. После этого срез промывают в дистиллированной воде и окрашивают.
Проведение окрашивания. При окраске водными красителями срезы переносят из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми — из спирта соответствующей концентрации непосредственно в красящий раствор (прямое окрашивание) или сначала в жидкость для протравки (непрямое окрашивание). Когда препарат приобретает нужную интенсивность окраски, его промывают в воде (или спирте) для удаления избытка красителя, а затем, если нужно, дифференцируют в соответствующей жидкости. Излишний краситель отмывают до тех пор, пока он не перестает переходить из среза в отмывающую жидкость.
Окрашивание срезов, наклеенных на стекла, можно проводить путем как помещения их в красящий раствор, так и накалывания красителя на срез. В первом случае применяют стеклянные стаканчики, кюветы или специальные металлические стойки, позволяющие одновременно окрашивать большое количество (до 40—50) стекол (рис. 79). Для окрашивания накалыванием в плоские чашки или ванночки кладут параллельно стеклянные палочки, на которые укладывают предметные стекла. Для того чтобы палочки не смещались, концы их соединяют резиновой трубкой. После этого на срез с помощью пипетки накапывают раствор
красителя. Если окрашивание длительное, то во избежание испарения красителя место расположения среза накрывают маленьким часовым стеклом или чашечкой. Подобный эффект можно получить, поместив предметные стекла с накапанным красителем в чашку Петри, одновременно положив рядом смоченную в воде вату. После того как чашка будет закрыта, происходит увлажнение воздуха, ведущее к значительному уменьшению испарения красящего раствора. Окрашивание свободноплавающих срезов, как и при предварительной подготовке, ведут в бюксах или на часовых стеклах.
