Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования - основы гистологии
В связи с тем, что электронная микроскопия все шире входит в исследовательскую практику морфологических лабораторий, лаборанту-гистологу необходим минимум знаний, достаточный для того, чтобы взять материал и приготовить го него блоки, которые затем могут быть обработаны специалистами, владеющими методом электронной микроскопии.
Общие положения
Принцип обработки объекта для исследования в электронном микроскопе основан на тех же положениях, что и подготовка тканей для изучения в светооптическом микроскопе (фиксация, промывание, обезвоживание, заливка, приготовление срезов).
Однако в связи с тем что исследование ведут на субмикроскопическом уровне и при помощи электронного (а не светового) пучка, методика подготовки объекта и техника получения среза имеют некоторые особенности о которых следует знать.
Видео: Методы изучения тканей
- Необходимо сосредоточить максимум внимания на том, чтобы избежать (или предельно уменьшить) изменений живых микроструктур, вызываемых кислородным голоданием и процессами распада, наступающими при прекращении жизнедеятельности объекта.
- Ввиду того что биологические мембраны, участвующие в образовании большинства живых микроструктур, имеют липоидно-белковый состав, возможно применение лишь тех фиксаторов, которые не растворяют липоиды и белки (четырехокись осмия, формалин, перманганат калия). Такие фиксаторы, как спирт, ацетон, дихлорид ртути (сулема), разрушая субмикроскопические структуры, делают невозможным электронно-микроскопическое исследование объекта.
- Толщина исследуемых срезов не должна превышать 0,3 мкм (300 нм1), т. е. они должны быть сверхтонкими. Изображение объекта в электронном микроскопе возникает в силу различной степени отклонения (рассеивания) электронов при прохождении их через различные по плотности участки среза, поэтому при большей толщине срезов на основное изображение будут накладываться изображения отдельных участков, расположенных выше (в направлении электронного пучка), что всегда повлечет за собой потерю четкости.
- Для получения ультратонких срезов необходимо, чтобы материал для заливки обладал определенными свойствами (эластичность, плотность, прозрачность и пр.). Обычно для электронно-микроскопических исследований объект заливают в синтетические (полимерные) среды: эпоксидные и полиэфирные смолы, а в некоторых случаях и в желатин.
1). Нм (нанометр)—1/1000микрона.
Видео: Анатомия человека Плечи и предплечья ч 1
Взятие материала и фиксация
Основой фиксации является соединение четырехокиси осмия с различными структурами объекта. Непосредственно воздействовать реактивом на ткань нельзя, так как происходят значительные изменения ее структурных компонентов. Поэтому процесс фиксации разбивают на два этапа: префиксация и постфиксация. Для лучшей сохранности структур необходимо применять реактивы, имеющие определенные pH и изотоничность, величины которых определяются видом фиксируемой ткани. Для префиксации применяют забуференный раствор глютаральдегида (обычно 3% концентрации). Постфиксацию осуществляют в 2% растворе четырехокиси осмия.
Прежде чем приступить к взятию материала, следует приготовить все необходимые растворы.
Префиксатор: к 0,1 м фосфатному буферу (pH 7,4) добавить 1% раствор хлорида кальция (из расчета 0,5 мл на 100 мл буфера). Во избежание образования осадка последний прибавляют по каплям, периодически встряхивая (буфер без хлорида кальция может храниться длительное время, с хлоридом кальция — до 2—3 дней). Затем на этой основе приготавливают 3% раствор глютаральдегида.
Постфиксатор: к 0,1 М фосфатному буферу (pH 7,4) добавляют четырехокись осмия и раствор глюкозы (для создания изотоничности раствора) по следующей прописи: 14 мл 6,71%Na2H PCL Н2О- 8,5 мл 2,52% NaOH- 5,5 мл 5,4% раствора глюкозы- 27,5 мл 2% раствора четырехокиси осмия- 0,3 мл 1% раствора хлорида кальция.
Приготовление 2% раствора четырехокиси осмия требует особой тщательности. Ампулу с четырехокисью осмия тщательно моют, затем надпиливают и, сполоснув дистиллированной водой, помещают в абсолютно чистую темную склянку, куда наливают дистиллированную воду в количестве, требуемом для получения 2% раствора. После этого чистой стеклянной палочкой разбивают ампулу (под водой). Получается прозрачный раствор слегка желтоватого цвета (раствор можно хранить длительное время на холоду до выпадения в осадок темных кристаллов).
Кроме перечисленных реактивов, необходимо иметь батарею спиртов восходящей концентрации (50, 70, 80, 95 и 100%), так как наиболее употребимые заливочные среды — эпоксидные смолы эпон и аралдит — нерастворимы в воде и материал перед заливкой необходимо обезводить. В связи с тем что в процессе обработки применяют малые количества растворов (5—10 мл), рекомендуется использовать посуду соответствующей вместимости (например, флакончики из-под пенициллина).
Имея необходимые реактивы, заливочные среды и желатиновые капсулы (№ 1 и 2), можно приступать к работе.
Существует два основных способа фиксации: 1) прижизненная перфузия органов 3% раствором глютаральдегида и 2) путем пропитывания небольшого участка исследуемого органа. Второй способ применяют чаще, так как он технически проще и требует меньшего количества дефицитных реактивов. Только после окончания всей подготовительной работы можно приступать к взятию материала и его фиксации. Это делают следующим образом. Животное фиксируют и наркотизируют нембуталом или эфиром (первый способ предпочтительнее). Затем осуществляют доступ к исследуемому органу (при этом животное должно дышать, а сердце его хорошо работать).
Префиксация: обнажив поверхность органа, с помощью шприца наносят на нее 25—30 мл 3% раствора глютаральдегида, через 5—10 мин вырезают острой бритвой тонкую (1 мм) ленту ткани и измельчают в капле префиксатора, налитого на пластинку плексигласа (величина кусочков измельченной ткани не должна быть более 1 мм3). Затем пипеткой собирают кусочки из капли префиксатора, переносят в бюкс с новой порцией префиксатора и помещают на 1—2 ч в холодильник. Затем кусочки ткани отмывают в четырех порциях фосфатного буфера с хлоридом кальция по 15—30 мин и приступают к следующему этапу.
Все эти и последующие манипуляции необходимо проводить по возможности быстрее и при температуре 0—4 °С, для чего в процессе обработки посуду с растворами помещают в чашку со льдом.
Постфиксация: кусочки ткани помещают в постфиксатор на 2 ч. После окончания фиксации производят отмывку в четырех свежих порциях фосфатного буфера с хлоридом кальция по 5 мин.
Обезвоживание, пропитывание и заливка
Обезвоживание: кусочки зафиксированной и промытой ткани проводят через батарею спиртов восходящей концентрации в следующем режиме:
Спирт 50% три порции » 70% » »
на холоду
Если необходимо, то на этом этапе можно держать объект до 24 ч.
Спирт 80% три порции
» 96% » »
» 100% » »
при комнатной температуре
Затем приступают к пропитыванию и заливке.
В настоящее время применяют несколько способов заливки в синтетические среды (аралдит, эпон, метакрилаты, вестопал и др.).
Приводим один из наиболее часто применяемых способов пропитывания и заливки в эпон.
Для этого следует приготовить ряд смесей.
Смесь А: эпон 812 (62 мл) + эпон DDSA (100 мл).
Смесь Б: эпон 812 (100 мл) 4- эпон MNA (89 мл).
В связи с тем что смешиваемые компоненты имеют вязкую консистенцию, необходимо тщательно перемешивать их в процессе приготовления. Каждую смесь можно готовить впрок и хранить в холодильнике до 1—2 мес.
Перед употреблением берут равные количества смесей А и Б и добавляют реактив-ДМР-30* (из расчета на 10 мл смеси А + Б 0,2 мл ДМР-30), вновь тщательно перемешивая до получения однородной гомогенной массы.
*Срок хранения всех применяющихся компонентов синтетических сред не должен превышать 1 год.
Пропитывание: поместить кусочки в среду из 100% спирта и полной смеси эпона (А + Б в соотношении 1 :1) на 1 ч. Затем провести через три порции полной смеси эпона (А + Б в соотношении 1 :1) по 1 ч в каждой.
На этом пропитывание заканчивают и переходят к следующему этапу.
Заливка: разливают с помощью пипетки по капсулам, предварительно просушенным в термостате, полную смесь эпона (А+Б в соотношении 1:1). Пропитанные смолой кусочки ткани захватывают стеклянной петлей или тонким изогнутым пинцетом и раскладывают по одному в каждую капсулу. Не давая кусочкам осесть на дно, капсулы ставят в термостат для полимеризации. Режим полимеризации следующий: 1) при температуре 35°С —24 ч- 2) 45°С — 24 ч- 3) 60°С — 24 ч.
Затем полимеризированные блоки вынимают из термостата. Через 1—2 дня блоки отмывают от желатиновых капсул. Для этого их помещают в банку с горячей водой на 10—20 мин. Готовые блоки зажимают в блокодержатель ультратома на сутки, затачивают в пирамиду и приступают к резке материала.
