Просветление и заключение срезов, заключение в смолы - основы гистологии
Просветление и заключение срезов
Для того чтобы окрашенный препарат можно было исследовать в проходящем свете и возможно дольше хранить, он должен быть прозрачным и защищен от высыхания, загрязнения и повреждения.
Все эти условия обеспечиваются просветлением и заключением препарата в специальные среды, которые и сохраняют его прозрачность, окраску и структурную целостность.
Среды для заключения можно разделить на две основные группы: а) смешивающиеся с водой (глицерин, гуммиарабик, желатин)- б) не смешивающиеся с водой (различные смолы). Вещества первой группы являются одновременно просветляющими и не требуют обезвоживания препарата, тогда как перед заключением препарата в смолы, его необходимо тщательно обезводить и просветлить в карболксилоле (толуол, бензол) или оптических маслах (бергамотовое, каепутовое, гвоздичное и др.). Несмотря на то что методика заключения препаратов в безводные среды (смолы) более сложная и повышает стоимость препарата, она применяется наиболее часто, так как имеет ряд важных преимуществ перед методикой заключения в водные среды. Основными из них являются: высокая степень прозрачности препарата, длительное сохранение его окраски и структур без изменений, удобство хранения. Наиболее распространенной смолой для заключения является бальзам (канадский или пихтовый).
Заключение в смолы
Обезвоживание (полное) препарата является обязательным предварительным условием его заключения в смолы.
Для этого находящийся в воде окрашенный препарат проводят через ряд спиртов возрастающей концентрации (60, 80, 96 и 100%).
Просветление препарата наступает уже в процессе обезвоживания, но, так как спирт не растворяет бальзам, его необходимо удалить. Для этого препарат помещают в один из растворителей бальзама, который, удаляя спирт, одновременно увеличивает прозрачность препарата. Чаще с этой целью применяют ксилол, который может быть заменен толуолом или бензолом.
При обработке целлоидиновых и не наклеенных желатиновых замороженных срезов следует 100% спирт заменять карбол-ксилолом, так как абсолютный спирт вызывает набухание первых и сморщивание вторых. Так как карбол-ксилол разрушает некоторые красители, пребывание в нем препаратов не должно превышать 3—4 мин, после чего необходимо тщательно промыть в двух порциях чистого ксилола.
Для того чтобы приготовить раствор карбол-ксилола, нужно расплавить в термостате (при 56°С) кристаллическую карболовую кислоту и затем смешать ее с ксилолом в соотношении 1:4, 1:6.
Следует помнить, что карбол-ксилол нарушает двойное лучепреломление веществ, находящихся в тканях, поэтому его нельзя использовать для поляризационных исследований.
Если необходимо избежать применения абсолютного спирта, помимо карбол-ксилола, можно использовать оптические масла (каепутовое, бергамотовое, гвоздичное). После удаления излишков спирта накапывают масло, затем через 2—3 мин срез промокают фильтровальной (гладкой) бумагой и, повторив подобную процедуру несколько раз, проводят его через ксилол (бензол, толуол).
Если нужно исключить обработку препаратов спиртами малой крепости (вымывание некоторых красителей — окраска пикрофуксином и др.), предметное стекло кладут на фильтровальную бумагу вверх препаратом и промокают срез сложенной в несколько раз гладкой* фильтровальной бумагой, осторожно накрыв ею препарат и проводя пальцем вдоль стекла. Затем так же осторожно удаляют фильтровальную бумагу и помещают препарат в 96% спирт. Дальнейшую обработку ведут, как обычно.
* Фильтровальная бумага, имеющая шероховатую поверхность, для этих целей непригодна, так как загрязняет препарат волоконцами.
Если препарат недостаточно освобожден от воды, то при его погружении в ксилол появляется беловатое помутнение. В этом случае препарат необходимо вновь поместить в абсолютный спирт для окончательного обезвоживания.
При переносе срезов из одной жидкости в другую необходимо, чтобы последующая порция не загрязнялась предыдущей. Особенно важно соблюдать это условие при переносе препаратов из спирта в ксилол. Поэтому жидкости дают хорошенько стечь, а если стекла сложены попарно, их обязательно при этом разъединяют и вытирают обратную сторону фильтровальной бумагой или тряпочкой. Однако не следует долго держать срезы на воздухе, так как они при этом подсыхают (возникает побеление) и портятся.
Можно производить обезвоживание и просветление как свободноплавающих срезов, так и наклеенных на стеклах. Однако при нахождении свободноплавающих срезов в крепких спиртах и карбол-ксилоле они сморщиваются, становятся хрупкими и плохо расправляются при размещении на предметном стекле. Поэтому там, где это возможно, свободноплавающие срезы (желатиновые, целлоидиновые и замороженные) необходимо наклеивать на предметное стекло до обезвоживания и просветления. Для этого срез переносят из воды в 70% спирт, куда опускают предметное стекло, на которое при помощи кисточки (или иглы) натягивают срез и расправляют. После этого стекло осторожно вынимают, удаляют фильтровальной бумагой избыток влаги вокруг среза и затем сильно прижимают гладкой фильтровальной бумагой, смоченной 96% спиртом (можно предварительно смазать стекло белок-глицерином). Дальнейшую обработку ведут, накапывая последовательно обезвоживающие и просветляющие растворы, периодически промокая срезы смоченной в спирте фильтровальной бумагой. При этом необходимо избегать высыхания срезов.
Обработка в биологических стаканчиках срезов, наклеены х указанным выше способом, нередко приводит к их отслаиванию.
Заключение срезов. Для обезвоженных и просветленных препаратов наиболее часто применяемой средой заключения является бальзам, представляющий собой прозрачную, желтоватого цвета древесную смолу. Бальзам обладает консервирующими свойствами, сохраняет прозрачность препарата и имеет показатель преломления, близкий к показателям преломления стекла. В последнем свойстве легко убедиться, взглянув на стеклянную палочку, погруженную в бальзам (часть, находящаяся в смоле, почти не видна).
Различают два вида бальзама — канадский и пихтовый. Способ приготовления их одинаков: кусок (или куски) затвердевшей смолы помещают в чистую сухую широкогорлую стеклянную банку и, залив ксилолом (или толуолом), ставят в термостат. Обычно приготавливают раствор жидкой консистенции, который фильтруют и оставляют в открытом сосуде (желательно в вытяжном шкафу). По мере испарения растворителя бальзам начинает загустевать. Когда консистенция его будет напоминать жидкий мед, раствор готов к употреблению.
Обычно бальзам имеет слабокислую реакцию. В тех случаях, когда кислая среда действует на окраску неблагоприятно, необходимо применять нейтральный бальзам, который получают путем добавления небольшого количества порошка карбоната калия или натрия. Хранят бальзам в специальных широкогорлых склянках, закрывающихся притертыми колпачками, шлиф которых смазывают тонким слоем вазелина. Если нет специальной склянки, можно использовать небольшой широкогорлый флакон из-под лекарств, закрывающийся эластичной хлорвиниловой пробкой. В центре пробки делают отверстие и вставляют в него стеклянную палочку, при помощи которой и извлекают бальзам.
Методика. Вынув стекло со срезом из ксилола, быстро вытирают тыльную сторону и, положив в горизонтальном положении на стол (или какую-либо плоскую подставку), наносят несколько капель бальзама. Затем берут приготовленное покровное стекло (чистым пинцетом или осторожно двумя пальцами за боковые края, чтобы не загрязнить поверхность), ставят его на предметное стекло рядом с препаратом под углом 45° и, как только бальзам растечется по краю покровного стекла, потихоньку опускают (рис. 80). При этом воздух постепенно вытесняется и бальзам покрывает препарат тонким, равномерным слоем. Покровные стекла нужно подготовить заранее. Помимо того что они должны быть абсолютно чистыми, их следует рассортировать на толстые и тонкие. Если окрашиваемый препарат предполагают исследовать с применением иммерсионного объектива, то его нельзя заключать под толстое покровное стекло, так как фокусное расстояние объектива окажется меньшим, чем общая толщина заключенного препарата, и фокусировка не будет достигнута.
Рис. 80.
Заключение срезов под покровное стекло.
Количество бальзама нужно рассчитывать таким образом, чтобы его хватило только на покрытие всей площади под покровным стеклом. Если бальзама мало, то останется свободное пространство между стеклами, если много, раствор растечется по предметному стеклу и испачкает его. В первом случае нужно нанести каплю бальзама на предметное стекло у того края покровного стекла, под которым остался воздух, и он заполнит пустоту. Если бальзам вытек из-под покровного стекла, его нужно тут же стереть тряпочкой, слегка смоченной в ксилоле. Заключенный препарат помещают на специальный планшет и кладут на покровное стекло груз на 24 ч для расправления. Если нужно сильно прижать (значительная неровность поверхности препарата), то применяют бельевые зажимы. Препарат должен находиться в горизонтальном положении не меньше 24 ч. После того как бальзам загустеет, препарату можно придавать любое положение.
Хранение. Хранить гистологические препараты следует защищенными от пыли и света. Наиболее целесообразный способ — хранение в специальных коробках с зубчатыми рейками. Хранение в папках менее удобно, так как не исключает запыления и требует много места. Хорошо высушенные препараты можно держать и в обычных картонных коробках (из-под конфет, папирос и т. д.). В этих случаях стекла складывают попарно спинками и каждую пару отделяют от последующей горизонтальной полоской плотной бумаги. Необходимые пометки делают на наружной поверхности стенок коробок.
Возможные погрешности при заключении: а) весь препарат покрыт мельчайшими пылевидными капельками (недостаточное обезвоживание)- необходимо сменить растворы, увеличить время обезвоживания- б) под стеклом разнокалиберные подвижные пузырьки (при заключении попал воздух)- если пузырьки расположены над препаратом и при легком надавливании препаровальной иглой на покровное стекло не исчезают, необходимо перезаключить препарат- для этого стекло с препаратом погружают в ксилол и держат до тех пор, пока покровное стекло сползет само или легко поддастся смещению препаровальной иглой- в) препарат пересекают бесструктурные или зубчатые объемные волоконца, на срезе расположены различные включения (загрязнение препарата в процессе проведения через растворы, загрязнен бальзам или же плохо очищено покровное стекло)- фильтруют растворы, тщательно протирают покровные стекла.
