Гистохимические методы - основы гистологии

Длительное время для изучения химического состава клеток и тканей пользовались исключительно классическими биохимическими методами, в основе которых лежит суммарное определение химических веществ в размельченной ткани (гомогенате). Однако, несмотря на свои положительные качества, эти методы не обеспечивали полного представления о локализации тех или иных химических веществ в различных структурных компонентах клеток и тканей. Поиски методов, с помощью которых можно было бы определять локализацию химических веществ в целостных микроструктурах органов и тканей, привели к созданию гистохимического метода, объединяющего в себе гистологический и биохимический методы.
При гистохимических реакциях неорганические и органические вещества, входящие в состав клеток, вступают в химическую реакцию с различными реактивами (красителями) и образуют окрашенные продукты реакции. По степени интенсивности этих продуктов можно до некоторой степени судить и о количественном содержании химического вещества в той или иной структуре. В основе большинства гистохимических реакций лежат общие принципы.

1. Определенные химические группировки окрашиваются тем или иным красителем. Например, фосфатные группы РНК образуют с основными красителями (пиронин, толуидиновый синий и др.) солеобразные окрашенные соединения.
2. Краситель растворяется в определенном субстрате, входящем в состав клеточных структур. Например, окраска жировых включений в клетке основана на растворении Судана в жировой капле.
3. Некоторые химические компоненты клеток, такие, как ДНК, полисахариды, неспособны реагировать с красителями. В таких случаях прибегают к превращению их химических группировок в реакционно-активное состояние (гидролиз ДНК хлористоводородной кислотой, окисление полисахаридов йодной кислотой). При этом освобождаются или создаются вновь химические группировки, которые способны реагировать с соответствующими реактивами, в результате чего образуется окрашенный продукт реакции.
4. При выявлении локализации некоторых компонентов клетки прибегают к многоступенчатым промежуточным реакциям и переводу неокрашенного продукта реакции в окрашенный. Например, так поступают при гистохимическом окрашивании ферментов (подробнее об этом см. ниже).

Новый метод получил широкое распространение в исследовательской практике. В настоящее время ни одна морфологическая лаборатория не обходится без применения гистохимических методик. Однако успешное владение ими требует усвоения определенных навыков и соблюдения ряда условий, так как в отличие от гистологических методик, носящих большей частью эмпирический характер, гистохимические основаны на определенных химических механизмах и обладают строгой специфичностью. Отсюда главное требование — особая точность и тщательность в работе. Критерием в оценке результатов гистохимической реакции является не только локализация химических веществ, но и интенсивность окраски исследуемых компонентов клеток и тканей, так как именно она свидетельствует о концентрации выявляемых веществ. Если при гистологической обработке материала возможны некоторые отклонения в ходе окрашивания препарата, то приемы, используемые для подготовки материала и проведения гистохимических реакций, должны тщательно соблюдаться, ибо отклонения на любом этапе могут изменить ход реакции и в конечном итоге привести к неправильной оценке препарата.
Для создания надлежащих условий протекания химических реакций особое внимание нужно уделить приготовлению рабочих растворов, а также чистоте применяемой посуды и стекол, качеству реактивов и т. д.
В настоящее время гистохимия перешла на количественный уровень исследования с применением специальных приборов (цитоспектрофотометров), позволяющих довольно точно определять количественную характеристику интенсивности окраски (продукта реакции), что особенно важно для оценки состояния метаболизма в исследуемых органах, тканях и отдельных клетках. Это еще в большей степени предъявляет повышенные требования к качеству проведения гистохимических реакций и соблюдению строгой стандартизации обработки сравниваемых объектов на всех этапах. Именно в этих целях в первую очередь применяют совмещение сравниваемых образцов в одном блоке с последующим получением срезов одинаковой толщины на одном стекле (см. с. 178).Когда это сделать невозможно, необходимо в ходе резки располагать разные срезы на одном предметном стекле. При любом способе совмещения сравниваемые срезы следует подвергать всем этапам гистохимических реакций одновременно, используя одни и те же порции реактивов.

Буферные растворы и их приготовление

Химические процессы, протекающие в тканях организма, особенно с участием ферментов, требуют наличия ряда условий, среди которых важное значение имеет pH среды. Как известно, степень кислотности данного раствора зависит от концентрации ионов Н+ , а степень его щелочности — от концентрации ионов ОН.
При определенной температуре произведение положительно и отрицательно заряженных ионов — величина постоянная. Зная один из показателей, можно определить другой. Исходя из этого положения, в химии принято обозначать кислотность или щелочность раствора условно через водородный показатель (pH), представляющий логарифм концентрации ионов Н+ , взятый с обратным знаком. Так, при pH 7,0 концентрация ионов Н+ равна концентрации ионов ОН" и раствор имеет нейтральную реакцию. Чем показатель pH меньше 7,0, тем концентрация ионов Н + выше (ведь показатель с обратным знаком) и тем больше кислотность раствора. Наоборот, чем pH больше 7,0, тем меньше ионов Н+ в растворе и более выражены его щелочные свойства.
Различные ферменты требуют для проявления своей активности разные значения pH. Так, оптимальное условие для действия щелочной фосфатазы при pH 9,0, тогда как для кислой фосфатазы требуется pH 5,0.
Чтобы обеспечить наилучшие условия для проявления активности гистохимически выявляемого фермента, необходимо, чтобы в среде инкубации поддерживалось значение pH, оптимальное для данного фермента. Это условие достигается введением в среду инкубации буферных смесей с заданными значениями pH. Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.

Приготовление буферных растворов

Прежде чем дать прописи буферных смесей, необходимо напомнить, что для определения концентрации растворов реактивов приняты понятия молярность (М) и нормальность (N).
Молярность раствора (М) — количество грамм-молей вещества, содержащихся в 1 л раствора. Грамм-моль — молекулярная масса данного вещества, выраженная в граммах. Например, для приготовления раствора в концентрации 0,2 М необходимо на 1 л раствора взять вещество в количестве, равном 0,2 его молекулярной массы.
Нормальность (N) — количество грамм-эквивалентов в 1 л раствора. Грамм-экивалент—количество данного вещества, химически равноценное в данной реакции 1 грамм- атому водорода. Поэтому:

Фосфатный буфер (pH 6,0—8,0). Растворы: А — 0,2 М КН2 РО4 (13,6 г соли в 1 л дистиллированной воды)- Б — 0,2 М Na2 НРО4 (31,2 г Na2 НРО4, 2Н2О в 1л дистиллированной воды).
Для получения 100 мл буфера нужного pH следует слить растворы А и Б в количествах, указанных в табл. 3.
Ацетатный буфер (pH 3,6—5,6). Растворы: А — 0,5N СН3 СООН (30 мл ледяной уксусной кислоты долить к 970 мл дистиллированной воды)- Б — 0,5NCH3 COONa (68 г соли растворить в 1 л дистиллированной воды). Слить растворы А и Б в количествах, указанных в табл. 4.
Таблица 3

Таблица 4

Трис-буфер (pH 7,2 — 9,0). Растворы: А — 0,2 М трис (оксиметил)-аминометана (24,3 г соли в 1 л дистиллированной воды)- Б — 0,1N НС1.
Слить указанные количества растворов А и Б и долить до 100 мл дистиллированной водой (табл. 5).
Как исходные растворы, так и сами буферные смеси могут храниться длительное время.
Таблица 5

Примечание. Если требуется приготовить буферный раствор иной молярности, чем указано в настоящем руководстве, то следует изменить лишь молярность исходных растворов, количественные же их соотношения для получения pH остаются неизменными.
Однако во избежание ошибок (качество реактивов, неточность при составлении) pH приготовленных буферных растворов перед употреблением следует проверять. Грубая проверка может быть осуществлена с помощью индикаторной бумаги, более точная — посредством специального прибора-потенциометра (рН-метр).

Выявление нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты (высокомолекулярные соединения сложного химического состава) играют чрезвычайно важную роль в обеспечении жизнедеятельности любой животной и растительной клетки. Рибонуклеиновая кислота (РНК) осуществляет синтез белков, а дезоксирибонуклеиновая (ДНК) — хранение и передачу наследственных признаков. Первая содержится в цитоплазме и ядрышках, вторая — в хроматине ядер. Столь важная роль нуклеиновых кислот является причиной большого интереса к изучению их содержания и распространения в органах и тканях организма. Существует несколько способов гистохимического выявления нуклеиновых кислот, но наибольшее распространение получил метод Браше (для выявления РНК) и метод Фельгена (для выявления ДНК).

Выявление РНК по методу Браше

(фиксаторы могут быть различные, но наилучшие Карнуа, Бродского и Ценкера- заливка в парафин)
В настоящее время этот метод во многом утратил свое былое важное значение в связи с тем, что результат реакции не поддается количественной оценке на цитоспектрофотометре. Вместе с тем данный метод еще довольно широко применяется в лабораториях (особенно, где нет цитоспектрофотометров) и само его освоение дает навык лаборанту в приготовлении и очистке химических растворов.
Сущность метода заключается в избирательном присоединении некоторых основных красителей к нуклеиновым кислотам (при настоящем методе — пиронина к РНК и метилового зеленого к ДНК).
Прежде чем приступить к гистохимической реакции, необходимо произвести очистку метилового зеленого, так как имеющийся в продаже препарат всегда содержит примесь метилового фиолетового, значительно искажающего результат окраски. Для этого к водному раствору метилового зеленого добавляют хлороформ (или амиловый спирт) и, закрыв сосуд, энергично встряхивают. После того как смесь отстоится, в ней отчетливо видны два слоя — темный верхний, представляющий водный раствор красителя, и нижний фиолетовый — хлороформ, окрашенный метиловым фиолетовым. Слив осторожно водный раствор, к нему вновь добавляют хлороформ и повторяют всю процедуру. Отмывание производят до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться в фиолетовый цвет. Очищенный и высушенный препарат может храниться длительное время.
Рабочие растворы
Раствор А: 5 % водного раствора пиронина 17,5 мл, 2% водного раствора метилового зеленого 10 мл, воды дистиллированной 250 мл.
Раствор Б: 0,5М ацетатный буфер с pH 4,8 (приготовление см. с.265).
Перед употреблением сливают равные объемы растворов А и Б (хранить не более недели).
Метод. 1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.

1. Поместить в раствор метилового зеленого — пиронина (от 100 мин до 20 ч).
2. Промыть в течение нескольких секунд в дистиллированной воде (увеличение сроков промывки приводит к вымыванию пиронина).
3. Высушить фильтровальной бумагой.
4. Быстро провести через абсолютный ацетон, смесь из равных частей ацетона и ксилола, 10% раствор ацетона в ксилоле.
5. Просветлить в двух порциях ксилола и заключить в бальзам.

Результат. РНК ядрышек и цитоплазмы ярко- красного цвета, хроматин ядер зеленый или сине-зеленый.
В целях проверки специфичности окрашивания на РНК ставят параллельно контрольную гистохимическую реакцию. Для этого путем специальной обработки из срезов удаляют РНК, после чего производят окрашивание метиловым зеленым — пиронином по описанной выше схеме.
Результат. Окраска пиронином не происходит, метиловым зеленым — ослаблена.
Наилучшим способом удаления РНК является обработка срезов ферментом рибонуклеазой (0,1—0,5 мг кристаллической рибонуклеазы в 1 мл дистиллированной воды) в течение 2—3 ч при 56°С.
При отсутствии рибонуклеазы можно произвести экстракцию РНК, помещая срезы в 10% раствор холодной хлорной кислоты (HCIO4) на 3—6 ч.

Реакция галлоцианина и хромовых квасцов с нуклеиновыми кислотами (РНК и ДНК) по Эйнарсону
(фиксаторы Бродского, Карнуа)
Данный метод в отличие от метода Браше более прост, надежен и позволяет количественно оценивать содержание нуклеиновых кислот с помощью современных цитоспектрофотометров, благодаря чему нашел широкое применение.
Приготовление раствора красителя
Растворить 5 г хромовых квасцов (пригодны лишь прозрачные фиолетовые кристаллы) в 100 мл дистиллированной воды. Добавить 0,15 г галлоцианина и смешать, встряхивая. Постепенно нагреть и довести до кипения. Кипятить 5 мин. Охладить до комнатной температуры, профильтровать и добавить дистиллированной воды, дополнив объем фильтрата до 100 мл. Проверить pH (должно быть 1,64),
Проведение реакции: довести срезы или мазки до воды . Окрашивать 48 ч при комнатной температуре. Быстро промыть, обезводить и заключить в бальзам.
Результат. Окрашиваются РНК и ДНК. 11эет структур, содержащих нуклеиновые кислоты, от ярко-синего до серого, в зависимости от марки красителя. Для разделения РНК и ДНК использовать нуклеазы (см, метод Браше).

Выявление ДНК по методу Фельгена

(фиксаторы различные, но наилучшие Карнуа, Ценкера- заливка в парафин)
Сущность метода заключается в том, что продукты расщепления молекулы ДНК, осуществляемого в слабокислой среде, взаимодействуя с бесцветной фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа), образует комплекс, обладающий пурпурной окраской. Таким образом, локализация продукта гистохимической реакции указывает местонахождение ДНК, а интенсивность окраски — ее концентрацию.

Видео: ТОЛСТАЯ КИШКА. LARGE INTESTINE. В световой микроскоп

Реактив Шиффа. Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды и, периодически встряхивая сосуд с раствором, продолжают кипячение в течение 5 мин. Затем охладив содержимое до 50°С, раствор фильтруют, добавляют 20 мл 1N раствора НС1 и охлаждают до 25 °С, после чего добавляют 1 г метабисульфита натрия (Na2S2О  5 ) или калия (K2S2O5 ) и оставляют в темноте. Через 18—24 ч в раствор всыпают 2 г активированного угля, встряхивают в течение 1 мин, отфильтровывают и хранят в темноте при 0—4°С. Готовый реактив Шиффа бесцветен или имеет светло-желтую окраску. Покраснение раствора в процессе хранения свидетельствует о его разложении и непригодности к употреблению.
Необходимо иметь в виду, что иногда в продажу поступает недостаточно очищенный основной фуксин. Поэтому если приготовленный раствор не отвечает предъявляемым требованиям, нужно взять основной фуксин из новой партии и вновь приготовить реактив.
Однонормальный раствор хлористоводородной кислоты (1N). К 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,19) добавляют 90 мл дистиллированной воды. Раствор может храниться длительное время.
Сернистокислая вода для промывки срезов. К 5 мл 10% бисульфита калия (K2S2O5) добавляют 5 мл 1N раствора НС1 и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Раствор бисульфита калия можно применять в течение 7 дней, сернистокислую же воду готовят перед употреблением и применяют однократно.
Метод. 1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.

1. Быстро ополоснуть в холодной IN НС1.
2. Поместить в IN НС1 при 60°С на 6 мин (стаканчик ставят в водяную баню).
3. Быстро ополоснуть в холодной IN НС1, а затем в дистиллированной воде.
4. Поместить в реактив Шиффа на 40—60 мин.
5. Осушить фильтровальной бумагой и ополоснуть в трех порциях свежеприготовленной сернистокислой воды по 1—2 мин в каждой.
6. Промыть в водопроводной воде до 10 мин (если нужно докрасить цитоплазму: срез помещают на 1—1,5 мин в 1 % водный раствор светлого зеленого или 0,5% спиртовой раствор прочного зеленого).
7. Обезводить, просветлить и заключить в бальзам. Результат. Участки ядер, содержащие ДНК, окрашиваются в красновато-пурпурный цвет (цитоплазма светло-зеленая).