Импрегнация по методу бильшовского-грос - основы гистологии
Импрегнация по методу Бильшовского — Грос в модификации Б. И. Лаврентьева
Одним из наиболее распространенных методов импрегнации периферической нервной системы является метод Бильшовского — Грос в модификации Б. Н. Лаврентьева.
Материал фиксируют сразу после смерти- можно сделать это и в более поздние сроки, но результат будет хуже. Для фиксации используют 12—20% нейтральный формалин или жидкость АФА следующего состава: 96% спирт, 1% раствор мышьяковистой кислоты* и нейтральный формалин в равных количествах.
При фиксации в нейтральном формалине в первые 2-3 дня следует сменить раствор фиксатора 2—3 раза, так как раствор мутнеет от крови и жира. Продолжительность фиксации 7 дней и больше. Количество фиксатора должно в 50—100 раз превышать объем кусочков. Время пребывания в фиксаторе зависит от объекта и целей исследования и подбирается опытным путем. Так, для выявления нервных окончаний в среде — 2—4 сут, нервных сплетений в гладкой мускулатуре — 10—20 сут. Если материал после длительного хранения в нейтральном формалине плохо импрегнируется, его следует перефиксировать в свежей порции фиксатора в течение нескольких суток.
* Мышьяковистая кислота растворяется плохо, поэтому ее раствор готовят заранее при температуре 37°С в течение 3—5 дней.
Фиксацию в жидкости АФА продолжают 1 ч. После этого материал переносят в 10% нейтральный формалин, несколько раз меняют раствор, выдерживая по нескольку часов в каждой порции. Затем материал переносят в 15% раствор нейтрального формалина, где он может храниться длительное время. Срезы готовят на замораживающем микротоме- толщина срезов 20—60 мкм (в зависимости от цели исследования). Перед резкой материал переносят из формалина в дистиллированную воду, срезы опускают также в баночку со свежей дистиллированной водой.
Подготовка посуды
Посуда, предназначенная для импрегнации, должна быть тщательно вымыта. После мытья с мылом ее помещают в раствор хромпика (см. с. 145) на 4—6 ч. Затем посуду складывают в большой сосуд и промывают проточной водопроводной водой не менее 1 ч (до 24 ч) и ополаскивают несколько раз дистиллированной водой. Посуду сушат в сушильном шкафу или, если часто используют, хранят в дистиллированной воде в специальной банке. Для переноса срезов необходимо иметь стеклянную с загнутым концом палочку- металлические палочки для этого не годятся.
Рабочие растворы
- Из химически чистого кристаллического нитрата серебра готовят 20% раствор нитрата серебра. Лучше использовать дистиллированную воду. Такой раствор нитрата серебра можно хранить в темной банке (или в темноте). Перед употреблением надо проверить раствор: если он потемнел, работать с ним нельзя.
- Для импрегнации необходимо приготовить аммиакат серебра. Этот раствор готовят на часовом стекле. Сначала наливают 5 мл 20% раствора нитрата серебра, в который по каплям добавляют 25% раствор аммиака. При этом образуется черный осадок. Затем аммиак крайне осторожно добавляют по каплям при непрерывном помешивании раствора на стекле стеклянной палочкой до растворения осадка. Лучше аммиачный раствор готовить небольшими порциями, меняя несколько раз на протяжении работы.
- Аммиачную воду готовят путем растворения 1 части 25% раствора аммиака в 2 частях дистиллированной воды.
- 20% раствор кислого формалина готовят на водопроводной воде. Для работы надо иметь запасной раствор в колбе (1 л). Раствор разливают в четыре—пять баночек или бюксов.
- Раствор хлорида золота готовят из расчета 1—2 капли 1 % водного раствора хлорида золота на 1 мл дистиллированной воды.
- Надо приготовить несколько порций дистиллированной воды.
- Необходима батарея для обезвоживания срезов и заключения их в канадский бальзам.
Техника импрегнации
Из дистиллированной воды срезы стеклянной палочкой переносят в 20% раствор нитрата серебра, где они находятся 20-30 мин и дольше в зависимости от объекта (время пребывания срезов в AgNО3 определяют опытным путем). Спустя указанное время срезы следует провести через три— четыре порции 20% раствора кислого формалина. В последней порции формалина не должно быть мути от среза.
Срезы вынимают из формалина и на стеклянной палочке подсушивают путем промокания их на фильтровальной бумаге и переносят в аммиакат серебра. Предварительно к нитрату серебра добавляют 1—2 капли раствора аммиака. Часовое стекло со срезами, погруженными в раствор аммиаката серебра, ставят на предметный столик микроскопа для выявления нервных элементов. При четком выявлении нервных волокон и окончаний импрегнацию следует прекратить и на 10—15 мин перенести срезы в аммиачную воду, где импрегнация прекращается.
После этого срезы промывают в нескольких порциях дистиллированной воды до исчезновения запаха аммиака. Далее следует перенести срезы в раствор хлорида золота. Это позволяет ослабить импрегнацию общего фона и более контрастно выявить нервные элементы. Здесь срезы выдерживают до тех пор, пока они не станут серыми или фиолетовыми, затем на несколько минут переносят в 5% водный раствор тиосульфата натрия. Долгое пребывание срезов в этом растворе приводит к ослаблению импрегнации.
Промыв срезы в нескольких порциях дистиллированной воды, их обезвоживают в спиртах и заключают в бальзам.
Результат. Элементы нервной системы выявляются в виде черных образований на общем светло- коричневом фоне.
Успех импрегнации зависит от многих причин. Уточнить время обработки срезов формалином и аммиакатом серебра можно только опытным путем- для разных тканей это время различно. Следует помнить, что для успеха импрегнации имеют значение чистота посуды и реактивов, время фиксации материала. В тех случаях, когда интенсивно импрегнируются элементы соединительной ткани и плохо выявляются нервные элементы, надо добавить 1—2 капли (и даже больше) аммиака на часовое стекло, где находится раствор аммиаката серебра. Если срезы быстро чернеют в аммиакате серебра, необходимо сократить продолжительность обработки срезов в 20% растворе формалина.
