Промывание, обезвоживание гистологического материала - основы гистологии
Успешная фиксация исследуемого объекта — лишь первое условие, необходимое для приготовления качественных микропрепаратов. Однако для того, чтобы добиться получения тонких срезов (в тысячные доли миллиметра), зафиксированный материал необходимо соответствующим образом подготовить: сделать достаточно плотным и в то же время нехрупким. Нужно придать ему такое состояние, чтобы при резке он не крошился и не деформировался, а срезался тонкими ровными слоями. Для этого ткань следует освободить от излишков фиксатора, обезвредить, пропитать и залить какой-нибудь уплотняющей средой.
Промывание
Цель этой процедуры — освободить исследуемый объект от излишнего количества фиксатора. Способ промывания зависит от методики фиксации. Например, после фиксирующих смесей, содержащих пикриновую кислоту, дихлорид ртути, трихлоруксусную кислоту, применяют этиловый спирт разной концентрации (см. предыдущий раздел). После фиксации в формалине, в жидкостях, содержащих хром, осмиевую кислоту, обычно употребляют воду. В большинстве случаев промывку кусочков тканей производят в проточной водопроводной воде. Наиболее удобно это делать, помещая объект в стеклянные или фарфоровые сита (рис. 60), которые закрывают пробкой и опускают в сосуд с проточной водой. Пробка обеспечивает плавучесть, а отверстия — постоянную циркуляцию воды. Если кусочек не прошит ниткой, то этикетку также помещают в сито. При отсутствии сита кусочек заворачивают в марлю и подвешивают за нитку в сосуд, наполненный водой. Верх сосуда закрывают марлей и проделывают в ней небольшое отверстие. На водопроводный кран натягивают резиновый шланг или привязывают шнур (полоску бинта), свободный конец которого пропускают через марлю в сосуд и пускают по нему несильную струю воды. Среднее время промывания 20 — 24ч.
Обезвоживание
Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата следует строго придерживаться правила постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани.
Рис. 60.
Промывка материала после фиксации.
После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации.
Для проведения процедуры приготавливают необходимое количество бюксов или стаканчиков с притертыми крышками, этикетируют их и заливают спиртами: 50, 60, 70, 80 и 96% (по два стаканчика), 100% (два стаканчика). Такой последовательный ряд сосудов получил название гистологической батареи.
Таблица 2
Приготовление спиртов различной концентрации
Спирты нужной крепости приготавливают заранее по специальной таблице разведения (табл. 2) из 96% спирта (для того чтобы приготовить 100 мл спирта крепостью 60%, необходимо взять 63 мл 96% спирта и 37 мл дистиллированной воды и т. д.).
Способ приготовления абсолютного спирта. Обычный спирт-ректификат содержит 96% чистого спирта и 4% воды. Для того чтобы получить абсолютный спирт, необходимо извлечь воду. Наиболее распространенным способом является обезвоживание при помощи прокаленного медного купороса (сульфат меди).
В основе этого метода лежит свойство сульфата меди отдавать и присоединять молекулы воды, меняя при этом свой цвет (прокаленный сульфат меди имеет вид сероватобелого порошка- который по мере присоединения воды приобретает синюю окраску).
Насыпав порошок прокаленного медного купороса (примерно 10 г на 100 мл спирта) в чистую стеклянную бутылку с притертой пробкой, наливают туда же 96% спирт. Затем бутылку встряхивают до равномерного распределения порошка. Подобную процедуру повторяют на протяжении 1—2 дней. По мере поглощения воды порошок приобретает синюю окраску. Однократная обработка, как правило, не дает обезвоживания, поэтому спирт переливают в другой сосуд, содержащий свежую порцию сульфата меди. Подобную процедуру повторяют до тех пор, пока осадок не перестанет приобретать голубой цвет. Обезвоженный спирт отфильтровывают в чистую посуду, которую плотно закрывают. Желательно проверить pH абсолютного спирта, так как после обработки сульфатом меди он может стать слегка подкисленным. Для нейтрализации достаточно прибавить небольшое количество карбоната кальция (СаСО3).
Если в лаборатории нет фабричного порошка безводного сульфата меди, то его можно приготовить самим, прокалив кристаллическую соль над огнем в широкой фарфоровой чашке (до тех пор, пока из синих кристаллов не образуется белый порошок). Для равномерного прокаливания необходимо перемешивать купорос стеклянной палочкой. Нельзя допускать почернения (особенно заметного по краям чашки), свидетельствующего о перекаливании. Таким же путем обрабатывают медный купорос, оставшийся после обезвоживания спирта.
Следует помнить, что порошок медного купороса сильно раздражает слизистые оболочки. Нужно проводить прокаливание в вытяжном шкафу или же защищать слизистые оболочки носа и рта обычной марлевой маской.
Испытание абсолютного спирта на содержание воды производят опусканием в него нескольких зерен карбида кальция. Появление характерного запаха ацетилена и помутнение свидетельствуют о наличии воды. Более грубый способ — прибавление нескольких капель абсолютного спирта к 4—5 мл бензола или ксилола. Помутнение жидкости указывает на то, что спирт содержит около 3% воды.
Если препарат промывали в воде, то обезвоживание начинают с 50% спирта, если же в спиртах (после жидкости Ценкера и др.), то объект помещают в спирт последующей крепости (из 70% в 80% и т. д.). При тонких цитологических исследованиях обезвоживание начинают с 10—20% спирта. Время пребывания кусочков в отдельных спиртах определяется их величиной и свойствами. Объекты средней величины (толщиной 5 мм) достаточно держать в слабых спиртах (до 60%) по 2—4 ч, а в более крепких — от 12 до 24 ч. Мелкие и более тонкие объекты можно проводить соответственно быстрее.
Для того чтобы спирт проникал в ткани равномерно со всех сторон, объект помещают на слой ваты (обычной или стеклянной) или подвешивают в стеклянном сите. При таком расположении кусочков спирт, отнимающий воду из тканей и стекающий ко дну, не мешает дальнейшему обезвоживанию.
Следует помнить, что длительное пребывание объекта в спиртах низкой концентрации приводит к мацерации тканей, в то время как передержка в спиртах высокой концентрации чрезмерно уплотняет их. Поэтому, если необходимо прервать процесс обезвоживания, то материал можно оставить (на несколько дней) в «индифферентном» спирте, крепость которого составляет 70—80%.
Необходимо также учитывать, что спирты в процессе обезвоживания довольно быстро загрязняются экстрагируемыми из тканей веществами и особенно жирами. Не следует использовать длительное время одни и те же спирты. Необходимо своевременно их менять.
В процессе обезвоживания могут быть допущены ошибки: 1) переуплотнение при полном обезвоживании- 2) нормальное уплотнение при недостаточном обезвоживании. Оба эти недостатка являются следствием несоблюдения оптимальных условий обезвоживания и отрицательно сказываются на дальнейшей обработке материала. Достижение хороших результатов дается только опытом, поэтому необходимо тщательно регистрировать все этапы и внимательно анализировать результаты (особенно при освоении методов).
Перед тем как перенести объект в 96% или абсолютный спирт, следует придать кусочку окончательную форму и размеры (обрезать поврежденные или излишние участки). Для полного обезвоживания следует проводить материал последовательно через две порции абсолютного спирта (по 12—24 ч).
