Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы - основы гистологии
Для морфологического исследования клеток крови и подсчета лейкоцитарной формулы приготавливают мазок крови. Правильно сделанный и хорошо окрашенный мазок является совершенно необходимым условием для получения достоверных результатов при изучении морфологических особенностей кровяных клеток и подсчете лейкоцитарной формулы. Мазок крови должен отвечать следующим требованиям: 1) начинаться на 1 см от начала предметного стекла и кончаться на расстоянии 2—3 см от его противоположного края, общая длина мазка должна охватывать 1/2-3/4 стекла- 2) быть равномерной толщины, а не волнообразным, хороший мазок толще всего вначале, затем постепенно истончается и заканчивается в виде следа («вид щеточки»)- 3) слой крови не должен достигать краев стекла, между ним и краем стекла всегда должно быть несколько миллиметров свободного пространства.
Мазки, превышающие 3/4 длины предметного стекла, бывают очень толстыми. В них эритроциты лежат густым слоем, прижаты друг к другу и образуют монетные столбики, что мешает исследователю рассмотреть их морфологию. Мазки короче Vi предметного стекла слишком тонкие: лейкоциты лежат очень редко и деформированы. Если отсутствует свободный от мазка край предметного стекла (что бывает при большом диаметре шлифовального стекла), то большие клетки перемещаются к краю мазка, вследствие чего неравномерно распределяются в нем.
В волнообразном мазке распределение клеток крови также неправильное — толстые участки содержат больше лимфоцитов, тонкие — больше моноцитов и сегментоядерных клеток.
Техника приготовления мазка. Предметные стекла, на которых будут делаться мазки крови, должна быть хорошо обезжирены и промыты. Для этой цели их помещают в раствор хромпика (смесь К2Сг2О7 + крепкая Н2 SО4) на 24 ч (с хромпиком надо обращаться крайне осторожно, так как брызги от него могут прожечь одежду, чулки). Затем стекла промывают под проточной водой в течение 24 ч, протирают насухо и кладут в банку со смесью спирт— эфир. Перед употреблением их сушат. К капле крови прикасаются предметным стеклом так, чтобы оно не касалось пальца. Капля крови переходит на стекло. Для того чтобы мазок был величиной в 1/2-3/4 предметного стекла, капля должна быть диаметром 2—5 мм. Предметное стекло берут в левую руку большим, указательным и средним пальцами так, чтобы капля крови была сверху. Шлифованное стекло, которым будут делать мазок, ставят под углом 30—45° на расстоянии 1—2 мм перед каплей, держа его большим и указательным пальцами правой руки. Шлифованное стекло сдвигают назад так, чтобы оно коснулось капли крови и капля растеклась в углу между шлифованным и предметным стеклом (движение назад помогает также убрать лишнюю кровь, если капля была слишком большой). Затем быстрым движением руки вперед делают мазок. Нужно, чтобы при приготовлении мазка большой и указательный пальцы правой руки скользили по краям предметного стекла и создавали необходимую опору для равномерного наложения слоя крови. Шлифованное стекло должно быть уже, чем предметное, чтобы края предметного стекла были свободны от мазка.
Если ширина шлифованного стекла такая же, как и предметного, то углы у шлифованного стекла отламывают, укорачивая на 1—2 мм. Шлифованное стекло можно заменить покровным.
Приготовление хорошего мазка крови, хотя и не является трудным делом, требует определенного навыка. Следует помнить, что неверно приготовленный мазок приводит к грубым ошибкам в результатах исследований. Качество мазка является до некоторой степени «аттестатом» работы лаборанта.
Окрашивание мазков крови. Приготовленные указанным способом мазки крови подсушивают, затем фиксируют с помощью метилового спирта (3—5 мин) или абсолютного спирта (100%) (10—15 мин) или ацетона (5 мин). Наилучшие результаты дает все же фиксация мазков метиловым спиртом* . Фиксирующие жидкости денатурируют белки клетки при сохранении их прижизненной структуры, а также закрепляют мазки на стеклах. Нефиксированные мазки легко смываются.
* Следует помнить, что метиловый спирт является сильнодействующим ядом, а ацетон—легковоспламеняющейся и взрывоопасной жидкостью, из-за чего их нельзя оставлять на рабочем месте (до и после употребления), посуда должна быть наглядно этикетирована и хранить раствор нужно в сейфе.
Видео: Форменные элементы крови: эритроциты, лейкоциты (Научфильм, учебное видео СССР)
Фиксирующие жидкости наливают в достаточном количестве на стекла или стекла с мазками погружают в банку с фиксатором. После фиксации и высушивания мазков приступают к их окрашиванию. Обычно применяют метод Романовского—Гимзы. В лабораториях всегда имеется готовый раствор разведенного красителя. Краситель Романовского—Гимзы состоит из щелочной (азур II) и кислой (эозин) частей. Азур II окрашивает структуры клеток в ярко-синий цвет, а эозин в розовокрасный. Щелочные части клеток связываются и окрашиваются кислыми красителями, а кислые — щелочными.
Рабочий раствор красителя получают разведением готового раствора дистиллированной водой (1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). Для хорошего окрашивания мазка имеют значение качество красителя, реакция и температура воды. Очень важно, чтобы дистиллированная вода, в которой растворяют краситель, имела нейтральную реакцию. Если реакция кислая, то слабым действием щелочного элемента красителя белые кровяные элементы окрашиваются плохо, а препарат становится красным. Если вода имеет щелочную реакцию, то слабеет действие кислого элемента краски, лейкоциты окрашиваются слишком интенсивно и препарат делается синим. Реакцию воды проверяют посредством гематоксилиновой пробы. В 4—5 мл воды бросают крупинку гематоксилина. Если вода имеет целочную реакцию, то окрасится ранее 3-й минуты. Если окрашивание наблюдается через 5 мин или совсем не происходит, то вода имеет кислую реакцию. Если же вода окрашивается через 1—4 мин в розово-фиолетовый цвет, то она нейтральна и годна к употреблению. При кислой реакции воды в нее прибавляют по каплям 1% раствор карбоната натрия, пока гематоксилиновая проба не станет характерной для нейтральной воды. При щелочной реакции добавляют по каплям 1% раствор уксусной кислоты. Для того чтобы правильно оценить результаты пробы, стаканчик с водой надо ставить на лист белой бумаги.
Окраску мазков производят по методу Романовского—Гимзы следующим образом. Перед окраской нужно предварительно проверить качество красителей, окрасив и просмотрев несколько мазков для того чтобы установить время, лучшее для окраски. Рабочий раствор краски готовят непосредственно перед окраской. Препарат помещают мазком вниз на 2 стеклянные (деревянные) палочки, положенные на дно чашки Петри. Краску подливают под препарат. Окрашивают 20—40 минут. Затем мазок промывают под струей воды, сушат и микроскопируют.
При окраске мазков крови по методу Романовского—Гимзы эритроциты окрашиваются в бледно-розовый цвет, ядра клеток — в сине-фиолетовый, гранулы эозинофилов — в ярко-красный, базофилов — в синий, цитоплазма лимфоцитов и моноцитов — в голубой цвет.
