Применение изотопов в гистологии - основы гистологии
Видео: Гистология и физиология матрикса. Сушков А.Л.
Метод авторадиографии
В отличие от гистохимии, которая позволяет определять лишь локализацию и концентрацию химических веществ в структуре, авторадиография, кроме того, позволяет изучать распределение различных веществ в клетках, тканях и органах всего организма, пути и механизмы их поступления и выделения из него и др. В основе авторадиографии (как светооптической, так и электронно-микроскопической) лежит процесс, аналогичный фотографическому, с тем лишь отличием, что «засвечивающим» фактором при авторадиографии является не свет, а ионизирующее излучение, испускаемое при распаде ядер радиоактивных атомов, введенных в организм в форме тех или иных соединений. Вместо же фотографической пластинки (пленки) используется специальная эмульсия, которой покрывают гистологические среды (а также мазки, отпечатки органов и т. д.) с целью обеспечения наиболее тесного контакта ее с исследуемыми структурами. После экспозиции, достаточной для того, чтобы кристаллы бромида серебра (входящие в состав эмульсии), находящиеся в непосредственной близости от места локализации радиоактивного изотопа, превратились в зерна металлического серебра, срезы проявляют, окрашивают, обезвоживают и заключают в бальзам. При микроскопировании автографов места локализации радиоактивных атомов выявляются в виде черных зерен. По количеству зерен можно судить (до некоторой степени) о количестве сконцентрированной в данной области радиометки.
Приводим использование метода авторадиографии для исследования процесса биосинтеза ДНК при митотическом делении клеток эпителия тонкой кишки у крысы.
Видео: AURORA - ОМОЛОЖЕНИЕ
- Крысе внутрибрюшинно вводят Н-тимидин (один из компонентов молекулы ДНК) из расчета 1 мк Ки на 1 г массы тела и забивают через 1—12 ч.
- Фрагмент тонкой кишки фиксируют (чаще всего в 10% формалине или жидкости Карнуа), обезвоживают и заливают в парафин.
- Приготавливают гистолические срезы толщиной
- 7 мкм.
- Депарафинируют в двух-трех сменах ксилола (толуола) по 1—2 мин.
- Высушенные срезы покрывают эмульсией при температуре 42°С (в фотокомнате при темно-красном фонаре).
- Укладывают в светонепроницаемую коробку и выдерживают в холодильнике 14—30 сут.
- Проявляет в амидоловом проявителе.
- Ополаскивают дистиллированной водой.
- Погружают в «стоп-раствор» (1% раствор уксусной кислоты) на 0,5—1 мин.
- Фиксируют в 30—40% растворе тиосульфата натрия 1 мин.
- Промывают проточной водой 20—30 мин.
- Высушивают на воздухе.
- Окрашивают гематоксилин-эозином (как обычно).
- Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации.
- Просветляют и заключают в бальзам.
Метод иммунофлюоресценции
Иммунофлюоресцентный метод — единственный в своем роде морфологический метод, позволяющий исследовать топографию в клетках и тканях сложных биологических веществ (эндогенного или экзогенного происхождения), наделенных индивидуально специфической структурой (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и др.). Сущность данного метода сводится к следующему. Веществом, идентичным тому, локализацию которого в исследуемом объекте (ткани, клетки) хотят изучить, иммунизируют другое животное и через определенное время (достаточное для выработки антител) из его крови получают антисыворотку. Антитела, содержащиеся в у-глобулиновой фракции антисыворотки, химическим путем соединяют с флюорохромом (особым соединением, способным давать яркое свечение — флюоресценцию — под действием ультрафиолетовых лучей). На гистологические срезы свежезамороженных или фиксированных органов (тканей) наносят каплю конъюгата — антисыворотки, соединенной с флюорохромом, и после 20—30-минутной экспозиции отмывают изотоническим раствором хлорида натрия несвязавшиеся флюоресцирующие антитела. Препарат заключают в забуференный глицерин или полистирол. Наблюдение проводят с помощью люминесцентного микроскопа в ультрафиолетовой части спектра. Вещества, с которыми специфически прореагировали антитела, выявляют по флюоресценции связанного с последними флюорохрома.
Наряду с описанным выше вариантом данного метода, получившим название прямой иммунофлюоресценции, была разработана другая его разновидность — непрямая иммунофлюоресценция, характеризующаяся, как правило, более высокой специфичностью по отношению к выявляемому субстрату. Метод непрямой иммунофлюоресценции отличается от прямого метода тем, что часть полученных после первой иммунизации антител (А-1) используют для иммунизации второго животного, в результате чего получают антисыворотку, содержащую антитела (А-2) к А-1. А-2 комплексируют с флюорохромом. На срезы наносят антисыворотку, содержащую А-1, и после отмывки антител, несвязавшихся с искомым веществом, антисыворотку, содержащую А-2 (флюоресцирующие). А-2 реагируют с А-1 и таким образом «фиксируются» в местах локализации исследуемого вещества.
Электронно-микроскопические варианты иммунофлюоресцентного метода имеют некоторые особенности. В одних случаях к антителам иммунной антисыворотки присоединяют какой-либо электронно-микроскопический агент (например, атом тяжелого металла), в других — соединение (группу), включающее в себя радиоактивный атом. В последнем случае для выявления локализации комплекса антиген—антитело необходимо проведение дополнительной авторадиографии.
Метод иммунофлюоресценции характеризуется большой чувствительностью. и позволяет обнаруживать вещества, присутствующие в клетках и тканях органа в очень низких концентрациях.
