Пропитывание и заливка гистологического материала - основы гистологии
Приготовление высококачественных гистологических препаратов требует наличия равномерно тонких срезов с исследуемого объекта. Для того чтобы их получить, кусочки тканей надо пропитать и залить такой средой, которая превратила бы их в хорошо режущуюся массу.
Следует помнить, что процесс пропитывания и заливки исследуемого материала требует большой тщательности. Незнание основных принципов и несоблюдение необходимых условий может привести к тому, что объект окажется непригодным для резки или полученные срезы будут некачественными.
Наиболее употребительными для этих целей материалами являются парафин, целлоидин и желатин.
Заливка в парафин
Этот метод широко распространен в исследовательских гистологических лабораториях благодаря относительной быстроте заливки (в течение 1—2 дней после обезвоживания), возможности приготовления серийных срезов, а также тонких срезов для цитологических исследований (толщина 1-3 мкм), удобству хранения блоков и неокрашенных срезов (практически неограниченное время). К недостаткам метода следует отнести значительное сжатие исследуемого материала (до 20%), вызываемое воздействием высокой температуры в процессе пропитывания парафином. Богатые водой, рыхлые ткани малопригодны к заливке в парафин. Известное неудобство представляет необходимость удаления парафина из срезов перед их окраской.
Парафин при комнатной температуре — твердое гомогенное вещество. Существует несколько сортов парафина: мягкие (точка плавления 45—54°С) и твердые (точка плавления 58—60°С).
В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54—56°С. Если резка предполагается при низкой температуре окружающей среды, то лучше применять парафин с более низкой точкой плавления (48—50°С). Нужная степень твердости парафина достигается смешиванием в различных комбинациях мягких и твердых сортов.
Если точка плавления парафина неизвестна, ее можно определить. Для этого расплавленный парафин насасывают в тонкий стеклянный капилляр и дают ему застыть. Затем очищают капилляр снаружи от приставшего парафина и вместе с градусником опускают в химический стаканчик с водой, которую начинают постепенно нагревать, перемешивая стеклянной палочкой. Как только парафин в капилляре начнет расплавляться, отмечают температуру, которая и укажет точку его плавления.
Следует помнить, что обычный продажный парафин часто содержит газообразные примеси, которые при заливке образуют пузырьки, придающие парафину повышенную ломкость и значительно ухудшающие качество резки материала. Для избавления от этих примесей свежий парафин следует на длительное время оставить в расплавленном виде в плоских чашках (чтобы увеличить площадь для выделения газов) при температуре 70°С (для этого можно приспособить сушильный шкаф). Можно также подвергать парафин частому расплавлению и нагреванию (до появления дыма) с последующим быстрым охлаждением.
Если парафин, несмотря на соответствующую подготовку, сохраняет жесткость, к нему следует добавить чистый пчелиный воск в количестве 2—5%, что придаст парафину большую эластичность.
Заливка в парафин требует тщательного соблюдения двух основных условий: 1) препарат должен быть полностью обезвожен, 2) не должен содержать спирт. Первое условие, как мы уже знаем, обеспечивается в процессе обезвоживания и уплотнения в батарее спиртов повышающейся концентрации.
Удаление спирта.
Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывают одним из растворителей парафина, обладающим способностью вытеснять спирт. К таким веществам относятся хлороформ, бензол, толуол, ксилол, сероуглерод и др. Чаще используют хлороформ и бензол. Толуол и ксилол делают кусочки более твердыми.
Следует помнить, что продажный разливной хлороформ может быть загрязнен и содержать воду, что несовместимо с требованиями, предъявляемыми к веществам, применяющимся в процессе подготовки объекта к пропитыванию. Для освобождения хлороформа от спирта и воды его настаивают длительное время над хлоридом кальция. Хранят хлороформ в темноте, так как на свету он легко разлагается.
Методика пропитывания.
Обезвоженные и уплотненные кусочки перекладывают из абсолютного спирта в смесь абсолютного спирта с хлороформом (1 : 1)на 2—3 ч, а затем в чистый хлороформ, где они вначале плавают (выступая над его поверхностью), а затем по мере пропитывания постепенно погружаются. В процессе удаления спирта хлороформ меняют 2—3 раза на протяжении 1,5—3 ч (в зависимости от свойств объекта и толщины кусочков). При величине кусочка 1 х 1 см его держат в хлороформе 30 мин. Затем, соблюдая принцип постепенного замещения хлороформа парафином, помещают объект в смесь из равных частей парафина (желательно мягкого) и хлороформа. Эта смесь, застывающая при комнатной температуре, при нагревании до 37°С расплавляется и приобретает жидкую консистенцию. Кусочки находятся в хлороформ-парафине при 37°С в течение 5-6 ч (при 56°С время сокращают до 30 мин — 1 ч). При необходимости отсрочить дальнейшую обработку материала можно после погружения объекта в смесь хлороформа с парафином извлечь сосуд из термостата и оставить при комнатной температуре на ночь (или даже на несколько дней) в закрытом состоянии, а затем, вновь расплавив в термостате при 56°С, перенести в рядом стоящий горячий парафин для пропитывания. Излишнее пребывание объекта в растопленном хлороформ-парафине ухудшает качество резания.
Для полного освобождения объекта от хлороформа кусочки проводят последовательно через две-три порции расплавленного парафина. Время пребывания в парафине зависит от величины кусочков и свойств ткани. Кусочки толщиной 2—5 мм должны в общей сложности находиться в парафине 2—5 ч.
Если объект хорошо обезвожен и не содержит спирта, задержка в парафине не ухудшает качество объекта даже при пропитывании в течение нескольких дней. 
Рис. 61.
Приспособление для парафиновой заливки. Объяснение в тексте.
При наличии же в кусочках остатков воды и спирта результаты обработки ухудшаются прямо пропорционально длительности излишнего пребывания объекта в расплавленном парафине. Парафин для пропитывания можно применять многократно, но при этом нужно строго следить за тем, чтобы не перепутать порции парафина. Для этого бюксы (или стаканчики) необходимо обозначить соответствующими цифрами (1, 2, 3).
Заливка.
После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально приготовленным для этих целей и хранящимся в термостате.
В качестве формочек для заливки используют разнообразные приспособления.
Г-образные гладкие угольники изготовляют из металла (латунь, свинец, сталь). Рекомендуется применять угольники, длинная сторона которых равна 8—10 см, короткая — 3 см, высота — 1,5—2 см. Угольники кладут на отполированную металлическую или стеклянную пластину и, сдвигая углы, создают формочку нужных размеров.
Бумажные коробочки изготовляют из листка плотной бумаги по схеме, представленной на рис. 61, где порядок номеров указывает очередность, а линии — направление сгибания листка. Применяют также фольгу, только в этих случаях следует сразу после заливки еще в жидкий парафин погрузить часть бумажной этикетки. Удобство бумажных формочек заключается в возможности значительно варьировать их размеры, простоте маркировки (простым карандашом на стенках) и длительном хранении залитого материала.
Для заливки мелких объектов можно применять часовые стекла, четырехугольные фарфоровые ванночки из-под акварельной краски и другие приспособления.
Заливку осуществляют следующим образом. Предназначенный для заливки парафин подогревают до 58—60°С и аккуратно наливают в приготовленную формочку, заполняя ее до самых краев и избегая образования пузырьков воздуха (хорошо иметь для этих целей высокую фарфоровую кружку с ручкой и носиком). Затем подогревают пинцет или металлический шпатель, быстро переносят подготовленный к заливке объект в формочку с парафином и ориентируют в необходимом положении. После этого формочку охлаждают водой (10—18°С). Если заливку производят с помощью металлических угольников, то пластину помещают в плоскую чашку таким образом, чтобы нижняя ее поверхность не соприкасалась с дном сосуда (на стеклянные или металлические палочки). Затем осторожно наливают воду до верхних краев формы (не заливая поверхность) и дают парафину застыть. При заливке в бумажной коробочке ее постепенно опускают в сосуд с водой и оставляют плавать до полного застывания парафина.
В процессе застывания поверхность блока кратерообразно стягивается, что необходимо учитывать при выборе высоты формы. Если форма недостаточно высокая или залита не полностью и парафин лишь тонким слоем покрывает объект, то при застывании верхняя часть кусочка будет выступать из блока.
Этикетировка материала должна производиться непосредственно перед заливкой, иначе кусочки легко могут быть перепутаны, особенно при заливке нескольких объектов в одной форме. Для этого при употреблении бумажных коробочек соответствующие данные наносят простым карандашом на стенку формочки. Если же блок должен быть извлечен из формы, то бумажную полоску с обозначениями вставляют в парафин до его застывания и, если нужно, делают дополнительные пометки на поверхности застывшего парафина препаровальной иглой или скальпелем.
Следует помнить, что: 1) при застывании парафин плотно прилипает к стеклу и отделяется с трудом, поэтому поверхность стеклянных приспособлений перед заливкой необходимо смазывать глицерином- 2) медленный перенос объекта в форму с парафином и употребление недостаточно нагретых инструментов (особенно, если в лаборатории прохладно) приводит к образованию на поверхности кусочков парафиновой пленки, значительно ухудшающей качество заливки- 3) применение очень холодной воды (температура ниже 10—8°С) приводит к стягиванию блока со всех сторон и деформации, а иногда и к трещинам- 4) медленное застывание блоков на воздухе, а также застывание под водой ухудшают качество заливки.
При хорошей заливке блок должен иметь плотную и однородную консистенцию. Рыхлые молочно-белые включения свидетельствуют о плохом качестве блока и значительно ухудшают резку материала, а иногда делают ее невозможной.
Таким образом, процесс заливки в парафин может быть представлен следующей схемой: промывание после фиксации, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации (в 50 и 60% по 4—6 ч- в 70, 80 и 90% по 8—12 ч и в двух порциях 100% спирта по 12—24 ч), проведение через смесь из абсолютного спирта и хлороформа (2—3 ч), погружение в чистый хлороформ (две—три смены в течение 1 Уг ч), пропитывание в хлороформ-парафине (при 37°С 3—6 ч), при 56°С 30 мин—1 ч), пропитывание в парафине (в трех порциях по 1—Уг ч), заливка в парафин1.
В тех случаях, когда по условиям работы необходимо сократить время приготовления парафиновых блоков, можно применить ускоренную заливку. Для этого кусочек ткани толщиной 1,5—2 мм помещают в абсолютный (или 96%) спирт либо ацетон (для фиксации и обезвоживания) на 1—2 ч, производя при этом однократную смену фиксатора.
Затем объект проводят в течение 1—1У2 ч через две смены чистого хлороформа (подогретого в термостате до 37°С), перекладывают на 30—60 мин в смесь хлороформа с парафином (1 : 1), после чего пропитывают в парафине 2 раза (по 45—60 мин) и заливают. При таком режиме весь процесс от взятия материала до заливки занимает 8—9 ч. Однако качество препарата ухудшается в основном в результате быстрого отнятия воды в спирте (или ацетоне). Поэтому применять этот метод нужно только в крайних случаях.
Для уменьшения затрат труда на гистол9гическую обработку материала и стандартизацию условий обработки созданы различные устройства, позволяющие автоматизировать процесс подготовки к резке (фиксация, уплотнение, обезвоживание, заливка) и даже окраску.
1). Если вместо хлороформа применять ксилол, то на соответствующих этапах сроки сокращаются примерно в 2 раза.
Принцип их работы основан на автоматическом перемещении пористого качающегося сосуда с обрабатываемым материалом через серию стаканов, содержащих необходимые растворы. Приборы питаются от сети переменного тока и снабжены механизмом, способным выполнять запрограммированный режим обработки в течение всего цикла и выключение по его окончании. Отечественная промышленность выпускает два типа аппаратов — АТ-3 и гистохроматор.
К недостаткам прибора следует отнести невозможность индивидуализации режима обработки кусочков различных по строению органов в случае их одновременной подготовки, невозможность тонкой дифференцировки при окрашивании, большой расход реактивов при работе с малым количеством объектов и др.
Приготовление комбинированных парафиновых блоков
За последние годы в лабораторной практике применяют способ одновременной заливки кусочков от нескольких сравниваемых органов в единый блок. Для этого подлежащие совместной заливке объекты проводят по спиртовой батарее одновременно и на том этапе, когда необходимо придать кусочкам окончательную форму, обрезают их края так, чтобы в нужной комбинации они могли тесно прилегать друг к другу и в то же время имели бы различную форму, позволяющую определить принадлежность каждого объекта. После этого кусочки проводят вместе через промежуточные среды, парафины для пропитывания и укладывают в формочку для заливки в определенном порядке, стараясь сблизить края в процессе заливки. Схему расположения кусочков и их обозначение сразу же заносят в протокольную тетрадь.
Подобные комбинированные блоки можно составлять и из уже залитых отдельно кусочков, придав им в твердом состоянии необходимую форму и поместив затем в горячий парафин, находящийся в термостате. После полного расплавления парафина кусочки заливают вместе в единый блок. Из удачно залитого блока, содержащего два, три, четыре кусочка, можно приготовить хорошие, ровные срезы. Такие комбинированные срезы незаменимы при гистохимических исследованиях. Оценку гистохимической реакции проводят по интенсивности окраски исследуемых микроструктур, а это значит, что сравниваемые срезы должны иметь одинаковую толщину и находиться в равных условиях при проведении как самой гистохимической реакции, так и остальных этапов обработки препаратов. Все эти условия и обеспечиваются при данном способе. Помимо этого, значительно облегчается микроскопирование препаратов и создаются условия для одновременного изучения сравниваемых срезов в общем поле зрения (при малых увеличениях).
Приготовление гистологических препаратов из комбинированных блоков (конечно, когда это оправданно) имеет и ряд технико-экономических преимуществ, так как сокращает время резки и всех последующих этапов обработки срезов, а также потребление стекол, реактивов и других материалов прямо пропорционально количеству залитых кусочков.
Наклейку блоков производят на деревянные кубики. Для этого из затвердевшего парафина скальпелем вырезают четырехугольный блок таким образом, чтобы объект со всех сторон был окружен слоем парафина толщиной 1—3мм. Затем, положив на деревянный кубик небольшой кусочек твердого парафина, расплавляют его горячим металлическим шпателем (или скальпелем), проводят этим же шпателем по нижней поверхности парафинового блока и быстро придавливают его к кубику.
Заливка в целлоидин
Этот метод очень распространен в практике патологоанатомических лабораторий, так как длительное пропитывание тканей и заливка их в среду без воздействия высокой температуры позволяет обеспечивать наилучшее сохранение микроструктур. Кроме того, при этом методе нет необходимости удалять из срезов заливочную среду.
Целлоидиновый способ также незаменим при исследовании легко расслаивающихся или деформирующихся материалов (стенка трахеи, целое глазное яблоко и др.). Недостатки метода — длительность процесса заливки, ограниченность времени хранения блоков и неудобство их содержания (в спирте), трудность получения тонких и серийных срезов.
В чистом виде целлоидин представляет собой вещество, растворимое в смеси с эфиром. Для заливки применяют 2%, 4% и 8% растворы целлоидина, которые необходимо приготовить заранее.
Исходным материалом может служить как готовый — продажный целлоидин в плитках, так и целлоидин, полученный из кино-, фото- и рентгеновской пленки. Нужно отметить, что не все сорта кинопленок можно использовать для этой цели. Годная к употреблению пленка должна растворяться в смеси абсолютного спирта и эфира.
Приготовление целлоидина из кино- и рентгеновских пленок начинают с удаления эмульсионного слоя, для чего пленку на 20—30 мин помещают в теплую щелочную воду (10—15% раствор карбоната натрия) и затем моют жесткой щеткой до полного очищения от эмульсии. После этого пленку тщательно промывают в теплой воде, ополаскивают проточной холодной водой в течение нескольких часов и высушивают при комнатной температуре. Высушенную пленку нарезают в поперечном направлении ножницами на полоски шириной 5—10 мм и обезжиривают в хлороформе в течение 24 ч. Затем кусочки помещают на чистую фильтровальную бумагу и сушат 10—12 ч, предварительно накрыв листом бумаги.
Стандартный целлоидин также предварительно нарезают на мелкие кусочки (или натирают на обычной кухонной терке) и высушивают на фильтровальной бумаге при комнатной температуре до полного затвердевания (предохраняя от запыления).
Приготовление растворов.
Для того чтобы получить 500 мл раствора целлоидина, берут 10 г высушенного целлоидина, насыпают в плотно закрывающийся стеклянный сосуд, заливают 250 мл абсолютного спирта и оставляют на 24ч, периодически взбалтывая (под действием спирта целлоидин набухает). Затем добавляют 250 мл безводного эфира, растворяющего разбухший целлоидин.
Таким же способом приготовляют 4% и 8% растворы. Приготовленные растворы нужно хранить в хорошо закрытых сосудах во избежание испарения жидкой среды и изменения концентрации раствора. Наилучшими для этих целей являются химические склянки с притертыми пробками и пришлифованными колпачками. Шлиф колпачка нужно смазывать вазелином. В таких сосудах растворы целлоидина могут сохраняться длительное время без изменения свойств.
Следует помнить, что эфир и сухой целлоидин очень огнеопасны, и при работе с ними принимать все меры предосторожности, предусмотренные для обращения с легковоспламеняющимися веществами.
Для приготовления целлоидиновых растворов необходимо пользоваться только безводным спиртом и эфиром, ибо даже незначительное количество воды затрудняет пропитывание объекта и нарушает процесс уплотнения, что в свою очередь ухудшает качество блока. Так как эфир для наркоза не содержит воды, то он вполне пригоден для приготовления целлоидина. Технический эфир нередко загрязнен водой, спиртом и другими веществами, поэтому необходима его предварительная очистка. Для этого в сосуд с эфиром засыпают гранулированный хлорид кальция (горсть на 1 л) и оставляют на 2—3 дня, затем осторожно отфильтровывают. Последнюю процедуру, если есть возможность, следует производить в вытяжном шкафу, закрывая воронку стеклянной крышкой во избежание испарения эфира (при этом нужно помнить о его легкой воспламеняемости). В отфильтрованный эфир добавляют металлический натрий (3—5 г на 500 мл) и закрывают пробкой, в которую вставлена стеклянная трубка, заполненная хлоридом кальция (для обеспечения выхода водорода и предотвращения попадания в сосуд паров воды из воздуха). Через 2 дня сосуд плотно закрывают обычной пробкой. В таком виде эфир можно хранить длительное время.
Если нет уверенности, что эфир безводный, нужно провести пробу. В пробирку с 2—3 мл эфира добавляют такое же количество сероуглерода и взбалтывают. Появление мути свидетельствует о наличии воды.
Пропитывание объекта целлоидином — довольно длительная процедура. Вначале тщательно обезвоженный в абсолютном спирте материал помещают в смесь из равных частей безводного спирта с эфиром (растворитель целлоидина), затем его переносят в жидкий 2% раствор целлоидина, который последовательно по мере пропитывания заменяют более густыми 4% и 8% растворами. Длительность пропитывания прямо пропорциональна плотности тканей и толщине кусочков и варьирует от 2 (для неплотного объекта толщиной 3—5 мм) до 6—7 дней в каждом растворе. По окончании пропитывания объект переносят в стеклянную чашечку с вертикальными стенками и плоским дном и заливают свежей порцией 8% раствора целлоидина с таким расчетом, чтобы после уменьшения объема заливочной среды вдвое (сгущение до 16% концентрации) над кусочком сохранялся слой целлоидина толщиной 2—3 мм. Более близкое расположение объекта к поверхности приводит к деформации препаратов за счет сил сжатия, возникающих в процессе сгущения раствора.
Затем форму с залитым материалом ставят в эксикатор на сетку, а под нее помещают чашечку с хлороформом, в парах которого и происходит уплотнение целлоидина до необходимой консистенции. Для того чтобы установить время окончания этого процесса, на наружную стенку чашечки наклеивают бумажную полоску с отметкой начального и конечного (вдвое меньшего) уровня раствора целлоидина. Нужно избегать быстрого сгущения и регулировать процесс, периодически закрывая формочку крышкой. По окончании уплотнения на поверхность целлоидина наливают 70% спирт и оставляют на ночь. Затем вырезают залитый материал в виде прямоугольных кусочков таким образом, чтобы вокруг объекта сохранялся слой целлоидина толщиной 2—3 мм. Вырезанные кусочки можно хранить длительное время в 70% спирте как в виде наклеенных на деревянные кубики блоков, так и ненаклеенными. В последнем случае каждый кусочек заворачивают в марлю, куда кладут бумажку с соответствующей надписью, сделанной простым карандашом.
Схематически весь процесс от фиксации объекта до приготовления блока выглядит следующим образом (при величине кусочка 1 х 1 см и более).
- Промывать в проточной воде 24 ч.
Рис. 62.
Пропитывание кусочков целлоидином по Кисели.
- Обезводить в спиртах восходящей крепости (включая две смены абсолютного спирта) — 12— 24 ч в каждом спирте.
- Поместить объект в смесь абсолютного спирта с эфиром (1:1) на 4—20 ч.
- Перенести в жидкий 2% целлоидин на 2—6 дней.
- Перенести в 4—6% целлоидин на 2—6 дней.
- Перенести в густой 8—10% целлоидин на 2—7 дней.
- Залить объект свежим целлоидином.
- Уплотнить в парах хлороформа в эксикаторе.
- Залить 70% спиртом, вырезать блоки и поместить их в 70° спирт для хранения.
Сроки каждого этапа подбирают опытным путем в зависимости от свойств исследуемого материала, размеров кусочков и качества целлоидина.
Существует способ заливки в целлоидин, при котором пропитывание производят в одном сосуде при постепенно повышающейся концентрации целлоидина (Д. Кисели) (рис. 62). Для этого после пребывания материала в двух сменах безводного спирт-эфира (1 : 1) его помещают в плотно закрывающийся широкогорлый сосуд, в который наливают известный объем (50 или 100 мл) свежего спирт-эфира. Затем в мешочек из марли насыпают измельченный сухой целлоидин в таком количестве, чтобы при полном его растворении концентрация раствора равнялась 8—10% (5 г на 50 мл). Мешочек подвешивают за нитку так, чтобы только его нижняя поверхность омывалась спирт- эфиром, после чего сосуд плотно закрывают пробкой. Целлоидин постепенно растворяется и непрерывно повышает концентрацию раствора. Срок пропитывания 4—10 дней. Если требуется ускорить растворение целлоидина, банку слегка наклоняют, если замедлить — приподнимают мешочек. По окончании пропитывания объект заливают обычным способом.
Следует знать, что быстрое появление на поверхности целлоидина плотной пленки (во время сгущения) свидетельствует о наличии в целлоидине воды. При таких условиях уплотнение будет неравномерным и среда может помутнеть, что значительно ухудшает качество резки и окраски. Рекомендуется освободить материал от целлоидина (поместив в безводный спирт-эфир) и залить новой порцией безводного целлоидина.
Если в процессе сгущения в целлоидине появятся пузырьки воздуха, то нужно на его поверхность налить безводный спирт-эфир и прикрыть чашечку крышкой. Обычно после этого пузырьки выходят на поверхность сами, если же нет, то их удаляют препаровальной иглой. Правильно приготовленный целлоидиновый блок должен быть почти прозрачным и иметь консистенцию школьной резинки.
Если же по условиям работы необходимо сократить время приготовления целлоидинового блока, то можно применить метод ускоренной заливки. Для этого тонкие кусочки исследуемой ткани (толщиной не больше 2 мм) выдерживают в двух—трех сменах 96% (или абсолютного) спирта на протяжении 6—8 ч (общее время), после чего помещают на 12—16 ч в густой (10—12%) целлоидин. Затем вырезают блок, наклеивают на деревянный кубик, уплотняют под стеклянным колпаком, положив рядом кусочек ваты, смоченной хлороформом, в течение 1—1х/2 ч. Хранят, как обычно, в 70% спирте.
Следует помнить, что качество срезов, приготовленных из таких блоков, значительно хуже, чем из блоков, залитых обычным способом. Применять метод ускоренной заливки нужно лишь в крайних случаях.
Наклейка целлоидиновых блоков. Деревянные кубики, предназначенные для наклейки целлоидиновых блоков, необходимо предварительно подвергнуть обработке с целью удаления из них экстрагируемых веществ. В противном случае эти вещества при хранении блоков в спирте переходят в раствор (или непосредственно в целлоидин), что значительно ухудшает качество блоков.
Наиболее распространенный способ заключается в следующем. Многократно кипятят деревянные кубики в течение нескольких дней (после каждого кипячения сменяют воду), затем несколько дней выдерживают в 70-80% спирте (или спирт-эфире), после чего тщательно высушивают.
Подлежащий наклейке целлоидиновый блок вынимают из спирта, промокают фильтровальной бумагой и помещают нижней поверхностью в смесь спирта и эфира (1:1) до начала растворения целлоидина (1—2 мин). Затем на поверхность деревянного кубика (целесообразно сделать ее шероховатой) наносят скальпелем или шпателем несколько капель 12—16% целлоидина, в который погружают блок. При этом нужно избегать сильного придавливания блока, так как вытесняется жидкий целлоидин и блок приклеивается непрочно. Наклеенные блоки через 5—10 мин кладут в широкогорлую банку с 70% спиртом, где они могут храниться длительное время. Предварительно их маркируют простым карандашом.
При длительном хранении блоков необходимо следить за цветом спирта и в случае появления желтоватой окраски производить замену его свежей порцией, так как пребывание в желтом спирте ухудшает окраску препаратов.
Заливка в целлоидин-парафин
Этот метод сочетает в себе преимущества парафиновой и целлоидиновой заливок. Применять его рекомендуется при обработке: 1) нежных объектов, которые легко сжимаются при парафиновой заливке (мезенхимная ткань, органы кроветворения и др.)- 2) органов, которые расслаиваются при резке в парафиновом блоке (трахея, кожа и др.).
Метод. Промывка и обезвоживание стандартные. Из безводного спирта материал помещают в смесь из равных частей спирта и эфира (4—20 ч), а затем в 2% раствор целлоидина. После полного пропитывания (24-48 ч) объект переносят в чистый хлороформ, где он находится до тех пор, пока не погрузится под его поверхность (30 мин — 1 ч). Затем материал на такое же время переносят в свежую порцию хлороформа (время подбирают в зависимости от размера кусочков и свойства материала). После этого объект промокают фильтровальной бумагой и переносят в растопленную смесь хлороформа с парафином, в которой держат 20 мин при температуре 58°С (после погружения кусочка сосуд можно оставить на столе до утра и даже на несколько дней). Последующие пропитывание и заливка, как при обычном парафиновом методе.
Существует модификация этого метода, согласно которой пропитывают материал в смеси из равных частей 2% раствора целлоидина и касторового масла 1—3 дня.
Затем объект переносят в хлороформ, который меняют трижды через 1 ч (для удаления касторового масла). Последующие этапы, как и при парафиновой заливке. Этот метод рекомендуется применять для заливки плотных объектов (кожа, трахея).
Заливка в желатин
Метод пригоден для эмбриологических исследований, заливки рыхлых тканей и органов (не вызывает сморщивания), при исследованиях с целью выявления жиров и липоидов. Режут желатиновый блок только на замораживающем микротоме.
Для заливки приготавливают два раствора: а) 25% раствор — 25 г размельченного или порошкообразного желатина растворяют в водяной бане (при 37°С) в 75 мл 1% раствора фенола (во избежание испарения сосуд должен быть закрыт)- б) 12,5% раствор — 1 часть густого раствора разбавляют 1 частью теплого 1% раствора фенола, для приготовления которого в 100 мл дистиллированной воды растворяют 1 г фенола при постоянном взбалтывании.
Приготовленные растворы желатина разливают в отдельные пробирки или другие небольшие сосуды порциями, пригодными для одной заливки (раствор используют однократно, так как повторное расплавление ухудшает застывание), и плотно закрывают пробкой.
Метод. Тщательно отмытый от фиксатора материал переносят для пропитывания сначала в жидкий (12,5%) раствор желатина на 3—20 ч (в зависимости от толщины и свойств объекта), затем на такой же срок в густой (25%) раствор (всю процедуру производят в термостате при 37°С, в хорошо закрытых пробками баночках во, избежание испарения воды и загустевания желатина, после чего заливают свежей порцией 25% раствора желатина), помещают в предварительно подогретые формочки и охлаждают в воде, внимательно следя, чтобы она не попала в желатин (летом воду следует предварительно остудить в холодильнике). После затвердевания желатина из него вырезают квадратные блоки, которые для уплотнения помещают на 24 ч в 20—25% раствор формалина и затем хранят в 10% растворе формалина.
Если уплотнение блока в формалине начинают слишком рано, то он делается скользким или ломким. Для удаления желатина из срезов их помещают в 10% раствор гидроксида калия (КОН) на 30 мин и держат в термостате при 37—40°С.
Потом срезы основательно промывают в водопроводной воде и окрашивают. Полного удаления желатина из срезов при этом не происходит.
