Безынъекционный метод изучения сосудов по в. В. Куприянову - основы гистологии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову (импрегнация нитратом серебра)
Данный метод позволяет не только выявить сосудистую сеть, но и определить строение сосудистой стенки и принадлежность сосудов к определенному звену микроциркуляторного русла, а также взаимоотношение сосудов с окружающими тканями.
Прежде чем приступить к импрегнации, изучаемый материал фиксируют в 12% растворе нейтрального формалина (ткани животных — не менее 7 сут, ткани человека — не менее 14 сут).
Из кусочков тканей приготавливают срезы на замораживающем микротоме (толщиной 20 мкм и более в зависимости от целей исследования).
Пленочный материал, состоящий из тонких пленок (брюшина и т.д.), импрегнируют целиком (тотально).
Толстые пленки предварительно расслаивают под бинокулярной лупой с помощью глазного скальпеля и пинцета.
Подготовка посуды — см. с. 145.
Рабочие растворы
Раствор нейтрального формалина 12% Раствор обычного (кислого) формалина 1%
Раствор обычного (кислого) формалина 0,5% (Все растворы формалина можно готовить заранее, так как они выдерживают длительное хранение.)
Раствор нитрата серебра 20% (приготовление и условия хранения см. с.249).
Раствор аммиаката серебра (готовят малыми порциями непосредственно перед помещением объекта, см. с.249).
Аммиачная вода — 25% водный раствор аммиака (можно готовить перед началом импрегнации и держать в плотно закрытой посуде)- разводят дистиллированной водой 1:1.
Спирт 60%.
Дистиллированная вода.
Водопроводная вода для удаления хлоридов (должна отстаиваться в сосуде не менее 1 сут).
Количество растворов определяется объемом предстоящей работы.
Техника импрегнации
- Промыть срезы в проточной воде 2 ч с последующим двукратным ополаскиванием в дистиллированной воде.
- Поместить в 60% спирт на 30 мин с последующим двукратным ополаскиванием в дистиллированной воде.
- Перенести в 20% раствор нитрата серебра на 1 ч (обязательно в темноте!) в термостат при температуре 37°С (в случае отсутствия термостата обернуть сосуд в черную бумагу и поставить под настольную лампу).
- Промыть в дистиллированной воде 3 мин.
- Провести через четыре стаканчика с 1% кислым формалином (если раствор в четвертом стаканчике еще мутнеет, то необходимо продолжить проведение до полной прозрачности последней порции).
- Просушить фильтровальной бумагой.
- Поместить в раствор аммиаката серебра на 2—3 мин.
- Перенести объект в 0,5% кислый формалин (подогретый до комнатной температуры) и держать до появления желто-коричневой окраски.
- Промыть в 25% растворе аммиака 3—5 мин.
- Промыть в дистиллированной воде до исчезновения запаха аммиака.
- Провести через батарею спиртов возрастающей концентрации (70%, 80%, 96% I, 96% II), карбол-ксилол и заключить в бальзам.
Результат: импрегнируемые структуры окрашены в коричневый цвет.
