Приготовление целлоидиновых срезов - основы гистологии
Видео: Этапы изготовления гистологических препаратов
Видео: ЯИЧКО МУЖСКОЕ гистологическое строение TESTIS
Для резки целлоидиновых блоков применяют ножи типа А и В с углом наклона несколько меньшим, чем при резке парафинового блока. Угол резания должен быть острым и зависит от плотности блока (чем мягче блок, тем острее угол). Закрепление и предварительную подготовку блока производят так же, как при получении парафиновых срезов. Во время резания нож и блок постоянно смачивают 70—80% спиртом. Целлоидиновые срезы имеют меньшую, чем парафиновые, склонность к свертыванию и не прилипают к ножу. Поэтому в случаях скручивания их можно расправлять кисточкой непосредственно на поверхности ножа.
Готовые целлоидиновые срезы собирают в 70% спирт, где их и хранят до последующей обработки, которую можно производить как со свободноплавающими срезами, так и после предварительного наклеивания их на предметные стекла. В последнем случае в отличие от парафиновых срезов наклеивание осуществляют непосредственно перед окрашиванием. Одним из распространенных методов является метод Рубашкина. Расправленный целлоидиновый срез переносят при помощи шпателя на смазанное белком с глицерином предметное стекло (при этом необходимо перенести как можно меньше спирта) и прижимают сложенной гладкой фильтровальной бумагой. Затем на срезы наливают чистое гвоздичное масло. После того как они полностью просветлятся (5—20 мин), масло сливают, предметное стекло со срезом помещают в 96% или абсолютный спирт, который сменяют 2—3 раза через 5—10 мин (для набухания целлоидина). После этого для полного растворения целлоидина наклеенные срезы переносят в спирт-эфир или метиловый спирт и затем проводят через спирты нисходящей концентрации (до воды).
Приготовление целлоидин-парафиновых срезов ничем не отличается от получения срезов при резании парафиновых блоков, наклеивание — также.
РЕЗАНИЕ НА ЗАМОРАЖИВАЮЩЕМ МИКРОТОМЕ
Обычно на замораживающем микротоме режут материал, фиксированный в формалине или спирте, а также залитый в желатину. Фиксация в жидкостях, содержащих дихлорид ртути, не рекомендуется, так как наличие ртути ухудшает качество резки (повреждается лезвие ножа).
Прежде чем приступить к подготовке материала для резки на замораживающем микротоме, необходимо проверить, есть ли в баллоне углекислота и поступает ли она в замораживающий столик. Для этого нужно открыть вентиль баллона с углекислотой и повернуть рукоятку, регулирующую подачу газа.
Подлежащий резке фиксированный материал помещают в сосуд с проточной водой и промывают несколько часов (обычно ставят на ночь). Затем вырезают кусочек толщиной 4—6 мм и кладут в чашку с дистиллированной водой.
Закрепив малый микротомный нож типа С винтами в пазах ножедержателя, устанавливают угол наклона около 45° и отводят в заднее крайнее положение. Затем извлекают подготовленный кусочек материала из воды, кладут на увлажненную поверхность замораживающей камеры или на подкладку из смоченной фильтровальной бумаги и ориентируют в нужном положении. После этого кратковременным открыванием и закрыванием крана подачи углекислоты производят замораживание исследуемого материала. Для ускорения замораживания камеру с препаратом накрывают специальным толстостенным стаканом, входящим в комплект микротома. Если таковой отсутствует, можно приспособить лабораторный стеклянный стакан соответствующих размеров. Одновременно с замораживанием объекта следует производить охлаждение ножа, подавая углекислоту через предназначенную для этого трубку.
По окончании замораживания (о чем узнают по затвердению и побелению препарата) устанавливают микрометрическую шкалу на нужную толщину среза и, поместив нож над объектом, вращением ручки подающего механизма поднимают столик с кусочком ткани до уровня лезвия ножа. Затем движением ножа за рукоятку на себя начинают резку материала. При каждом отведении рукоятки в крайнее заднее положение столик с препаратом автоматически поднимается на заданную высоту. Срез снимают с ножа пальцем или кисточкой и помещают в чашку с дистиллированной водой, где он сразу же расправляется. Если срезы нужно некоторое время сохранить, то после расправления в воде их следует перенести в 10—12% раствор формалина.
Желатиновые блоки режут таким же образом, только охлаждение их более длительное, а примораживание происходит лучше, если накапывать на столик не воду, а раствор желатины, предназначенный для пропитывания объекта. Качество резки также улучшается, если после первого замораживания блоку дать оттаять и затем заморозить его вторично. Собирать срезы следует в холодную воду или 30° спирт, где они легко расправляются. При необходимости хранения срезы переносят в 10% раствор формалина.
Полученные с помощью замораживающего микротома срезы обрабатывают преимущественно свободноплавающими. Однако при необходимости их можно предварительно наклеить на предметное стекло. Для этого их помещают в 30% спирт, затем переносят на предметное стекло, смазанное белком с глицерином, расправляют и прижимают гладкой фильтровальной бумагой, смоченной 30% спиртом. После этого срезы переносят в смесь из 50 мл 50% спирта и 7,5 мл формалина (на 1 мин), тщательно промывают дистиллированной водой и окрашивают.
Получение хороших срезов из свежего, нефиксированного материала на обычном замораживающем микротоме затруднено, особенно если дальнейшая обработка не допускает фиксации (например, гистохимическое выявление ферментов).
Последние модели отечественных и зарубежных замораживающих микротомов имеют специальные приспособления для охлаждения ножа. Если микротом старой конструкции, то охладить нож можно, приспособив к нему лоточек с сухим льдом.
При резке нефиксированных замороженных блоков охлажденным ножом срезы не сворачиваются и могут быть перенесены холодной кисточкой прямо на предметное стекло, к которому они прилипают и присыхают без клеющих средств.
Как и при заливке в специальные среды, при резке на замораживающем микротоме возможно одновременное приготовление срезов из двух кусочков. Для этого из сравниваемых объектов вырезают кусочки различной формы, располагают рядом на столике, замораживают и режут, Неодинаковая форма срезов позволяет легко различать их. Последующую обработку ведут также одновременно, а после окраски сравниваемые срезы укладывают на одно предметное стекло и приготавливают комбинированный препарат.
Однако наилучшие срезы из свежезамороженной ткани получают в специальном холодильном аппарате — криостате.
Основные приемы работы с криостатом. Прежде чем брать материал для приготовления свежезамороженных срезов в криостате, следует положить в камеру микротомный нож, кисточку, скальпель, препаровальную иглу и подставку для стекол, включить криостат в холодильный агрегат и подождать, пока температура в камере не достигнет рабочего режима (—12 —15°). Затем материал помещают на снятый с микротома блокодержатель, смочив предварительно поверхность водой, ориентируют в нужном положении и примораживают (можно использовать сухой лед, углекислоту, петролейный эфир, хлорэтил).
Если материал нужно брать срочно и нет времени ждать, пока криостат войдет в рабочий режим, блокодержатель с примороженным объектом следует обернуть холодной фольгой или положить в охлажденный бюкс для предупреждения вымерзания влаги и поместить в морозильную камеру холодильника (при условии, что температура там не выше —8—10°С). Основное требование — не дать блоку оттаять. Так же можно хранить замороженные блоки в течение нескольких дней. Перенеся блокодержатель с объектом в холодильную камеру, насаживают его на микротом. После этого с помощью уже находящегося в камере охлажденного скальпеля придают кусочку необходимую форму, закрепляют в микротоме нож и приступают к резке.
Если степень охлаждения объекта подобрана правильно (для материала различной плотности требуется неодинаковый температурный режим) и противосвертывающее приспособление хорошо отрегулировано, то срезы хорошо ложатся на нож. При скручивании срезов их необходимо расправлять на ноже, для чего, как только нож врежется в блок, следует слегка прижать кисточкой к ножу начало среза и вести нож книзу по мере срезания с блока. Чистое обезжиренное сухое стекло комнатной температуры вносят в камеру и осторожно приближают к срезу. Благодаря разности температур срез отрывается от ножа и прилипает к предметному стеклу. Стекла со срезами подсушивают при комнатной температуре или же фиксируют в различных жидкостях в зависимости от дальнейшего метода обработки. При резке в криостате нефиксированных объектов возможно приготовление препаратов, совмещенных из шести и даже восьми кусочков. При этом склеивание и смерзание их настолько тесное, что границу трудно различить даже в микроскоп.
Следует помнить, что для получения хороших срезов кусочек должен быть охлажден до определенного состояния. Если срез крошится, то объект переморожен и нужно немного подождать, пока он, оттаивая, не приобретет надлежащей твердости. Если же срез мнется, то объект недостаточно охлажден и его нужно слегка подморозить.
