Выявление полисахаридов - основы гистологии

Выявление полисахаридов (кислых и нейтральных)*
Полисахариды — высокомолекулярные сахара, встречаются в тканях организма как в чистом виде (гликоген), так и в соединении с другими веществами (мукополисахариды, мукопротеиды, гликопротеиды). Гликоген является резервом сахара в организме и содержится главным образом в печени и мышцах. Мукополисахариды — это полисахариды, содержащие в качестве одного из компонентов гексозамин. Они являются существенным компонентом слизеподобных веществ в организме, почему и получили свое название (лат. mucus — слизь).

*Кислые мукополисахариды теперь называют гликозаминогликанами, а нейтральные — гликопротеидами. Однако мы оставляем в тексте старые термины, так как они фигурируют в большинстве существующих методических руководств по гистохимии.

Мукополисахариды подразделяют на нейтральные и кислые. Последние распространены в животном организме очень широко (слизь эпителиев пищеварительного тракта и протоков большинства желез, основное вещество соединительной ткани и т. д.), их в свою очередь делят на простые (гиалуроновая кислота) и сложные (мукоитинсерная и хондроитинсерная кислоты- гепарин). Мукополисахариды, прочно связанные с белком, называют мукопротеидами и гликопротеидами. Они входят в состав слизеподобных веществ и секрета ряда желез.
Полисахариды и их комплексы — весьма лабильные соединения, чутко реагирующие на разнообразные сдвиги обменных процессов в организме.
Вещества полисахаридной природы играют важную роль в обеспечении нормальных физиологических процессов и занимают ведущее место в развитии ряда патологических процессов, особенно связанных с заболеванием соединительной ткани. Поэтому изучение динамики изменения содержания и распределения различных полисахаридных компонентов в организме имеет большое значение в исследовательской практике, а выявление и дифференцировка полисахаридов — одни из существенных разделов гистохимии.

Реакция — шифф-йодная кислота (ШИК-реакция)

В основе гистохимии веществ, содержащих полисахаридный компонент, лежит реакция шифф-йодная кислота (ШИК-реакция).
С помощью этой реакции можно выявить гликогены, мукопротеиды, гликопротеиды и гликолипиды.
Рабочие растворы
Реактив Шиффа (способ приготовления см. выше — с. 270).
Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавить 4 мл концентрированной НС1. В 25 мл дистиллированной воды растворить 4 г безводного сульфита натрия. Оба раствора соединить.
Раствор перйодата. Растворить 1 г перйодата калия или 2,5 г перйодата натрия в 100 мл дистиллированной воды.
Метод
(фиксаторы Шабадаша, спирт, формалин, жидкость Карнуа, жидкость Ценкера- заливка в парафин, замороженные срезы).

1. Срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
2. Погрузить в раствор йодной кислоты на 5—10 мин или перйодата натрия либо калия на 20—30 мин.
3. Тщательно промыть в двух—трех порциях дистиллированной воды (по 3—5 мин), чтобы удалить остаток йодной кислоты.
4. Поместить в реактив Шиффа на 10—20 мин.
5. Обработать в трех порциях свежеприготовленной сернистой воды (по 1—2 мин).
6. Промыть в водопроводной воде в течение 10 мин, ополоснуть в дистиллированной.
7. Обезводить, просветлить и заключить в бальзам (если нужно окрасить ядра, то после шестого этапа производят докрашивание срезов гематоксилином).

Результат. Вещество полисахаридной природы окрашено в пурпурно- или лилово-красный цвет. Нейтральные мукополисахариды бывают обычно пурпурно-красными, гликоген — более темный.
Примечание. Обработку реактивом Шиффа следует проводить в хорошо закрывающихся биологических стаканчиках, обернутых в черную бумагу. Одну порцию реактива можно применять многократно (до появления красноватой окраски).
Если на срезах появляются грязно-коричневые пятна, это свидетельствует о том, что окисляющий раствор не был полностью промыт перед обработкой срезов реактивом Шиффа.

Дифференцировка веществ, дающих ШИК-положительную реакцию

ШИК-положительную реакцию, помимо гликогена, дает группа веществ полисахаридной природы —гликолипиды, гликопротеиды, мукопротеиды, а также некоторые вещества, не содержащие углеводов: фосфолипиды, липопротеиды и некоторые липиды. Поэтому, для того чтобы определить, какое из веществ присутствует в исследуемых тканях в каждом конкретном случае, необходимо провести дополнительные реакции для уточнения ШИК-положительных веществ.
Расщепление гликогена. Применяют готовый препарат диастазу или фермент, содержащийся в слюне.
В первом случае к 0,1% 0,02М раствору диастазы в фосфатном буфере с pH 6,0 добавляют хлорид натрия (поваренная соль) до концентрации 0,8%, во втором собирают несколько кубиков слюны и отфильтровывают в стаканчик.
Метод. 1. После депарафинирования и доведения до воды один—два среза помещают в раствор диастазы (или слюны) и ставят в термостат при 37°С на 30—60 мин, остальные оставляют в воде.

1. Промывают срезы в дистиллированной воде вместе с остальными срезами (необработанными ферментами) и подвергают ШИК-реакции по описанному методу.

Результат. 1. Отсутствие окраски в срезах, инкубированных в растворе, содержащем фермент (контрольные), свидетельствует о том, что ШИК-положительная реакция в остальных срезах обусловлена наличием в тканях гликогена- 2) если все срезы окрашены одинаково, это значит, что гликоген отсутствует и окраска обусловлена другими веществами, дающими ШИК-положительную реакцию- 3) если контрольные срезы окрашены менее интенсивно, чем остальные, следует считать, что часть ШИК-положительного материала составляет гликоген.
Реакция ацетилирования. Контрольные срезы обрабатывают в течение 1—24 ч при 21° С в смеси мл уксусного ангидрида и 24 мл сухого пиридина, промывают водой, обрабатывают в течение 1 ч в растворе гидроксида натрия (0,4 мл NaOH на 100 мл дистиллированной воды), промывают в воде и проводят ШИК-реакцию. Отрицательные результаты указывают на то, что первоначальная реакция была обусловлена присутствием углеводных веществ (1—2 гликолевые группы).

Видео: Биология. Выявление жиров в крупах. Видео 2

Экстракция липидов. Срезы выдерживают в тление 29 ч в смеси из разных частей хлороформа и метанола при 58°С. Если при ШИК-реакции окраска исчезает или уменьшается, то она была обусловлена липидными веществами.
Реакция — шифф-надуксусная кислота. Срезы, предварительно обработанные 1—2 ч в растворе надмуравьиной или надуксусной кислоты, затем окрашивают реактивом Шиффа. Наличие в них структур, окрашенных в красный цвет, указывает на содержание липидов с ненасыщенными связями (фосфолипиды или цереброзиды).
Обработка срезов трипсином. Если в предварительно обработанных трипсином срезах исчезает или уменьшается ШИК-положительная реакция, то она была обусловлена белковыми веществами.

Выявление гликогена кармином по методу Беста

 (фиксаторы — Буэна, Карнуа, спирт, формалин и пр.)
Рабочие растворы
Основной раствор кармина. Растворить в 60 мл дистиллированной воды 2 г кармина, 1 г карбоната калия и 5 г хлорида калия. Полученный раствор кипятить в течение 5 мин (не допуская бурного кипения), охладить и отфильтровать. Затем добавить к фильтрату 20 мл 28% раствора аммиака. Хранящийся в холодильнике при 0—4°С раствор годен в течение 3 мес.
Раствор кармина для окрашивания. Слить 8 мл основного раствора, 12,5 мл аммиака (плотность 0,880) и 24 мл метанола (раствор годен 1—2нед).
Раствор Беста для дифференцировки. К 8 мл абсолютного спирта добавить 4 мл метанола и 10 мл дистиллированной воды.
Метод окрашивания (парафиновые срезы)

Видео: Павлин спаривается в минском зоопарке.

1. Довести срезы до абсолютного спирта.
2. Поместить в 1% раствор целлоидина на 2—5 мин.
3. Высушить на воздухе.
4. Довести через спирты до воды.
5. Окрасить гемалауном Эрлиха 5 мин.
6. Ополоснуть в воде и отдифференцировать окраску ядер в 1% подкисленном спирте.
7. Ополоснуть в дистиллированной воде.
8. Поместить в карминовый раствор для окрашивания на 15—30 мин.
9. Дифференцировать в растворе Беста (не ополаскивая предварительно в воде) от 5—10 с до нескольких минут, пока не перестанут отходить облачка красителя (если раствор быстро загрязнился, то сменить).
10. Промыть в 80% спирте.
11. Обезводить, осветлить и заключить в бальзам.

При окрашивании целлоидиновых срезов первые три этапа опускаются, так как они предназначены для обеспечения целлоидиновой защиты срезов.
Результат. Ядра темно-синие, гликоген ярко-красный.
Примечание. В связи с тем что в состав красителя входит аммиак, окраску следует производить в плотно закрывающихся сосудах. Контрольные срезы обрабатывают диастазой так же, как при ШИК-реакции.