Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание - основы гистологии
Обработка и окрашивание костной ткани
Костная ткань по физическим свойствам занимает особое место среди тканей организма. Наличие в ее межклеточном веществе солей кальция придает ткани твердость, значительно затрудняющую приготовление гистологических препаратов, поэтому обработка костной ткани имеет свои особенности. Существуют два основных способа получения гистологических препаратов: 1) приготовление срезов после специальной предварительной подготовки объекта, суть которой сводится к растворению и удалению из костной ткани неорганических солей (декальцинация)- 2) приготовление тонких костных пластинок (шлифов) из кусочков нефиксированной компактной кости путем стачивания последних.
Декальцинация
Прежде чем приступить к декальцинации, кость, как и любую ткань, необходимо подвергнуть фиксации. Выбор фиксатора зависит от целей и характера исследования. Так, для обзорных препаратов и выявления фибриллярных компонентов костной ткани применяют чистый формалин (15—20% раствор), в то время как для цитологических исследований предпочтительней сложные фиксаторы, также содержащие формалин, ибо он уменьшает степень набухания волокнистых структур при последующей обработке ткани (например, фиксатор Штиве: насыщенный водный раствор дихлорида ртути — 76 мл, формалин — 20 мл, ледяная уксусная кислота — 4 мл).
Для фиксации следует выпиливать лобзиком небольшие кусочки кости (толщиной 0,5—1 см), так как из-за высокой плотности ткани фиксатор проникает медленно. Срок фиксации зависит от толщины кусочка (не менее 48 ч).
По окончании фиксации объект тщательно промывают в проточной водопроводной воде или спирте (например, после сложных фиксаторов, содержащих дихлорид ртути), так как при последующей обработке кислотами могут образоваться труднорастворимые осадки. После этого в целях обезжиривания препарат проводят через ряд спиртов повышающейся концентрации (50, 70 и 96%), а затем доводят до воды через спирты нисходящей концентрации.
Декальцинация достигается обработкой костной ткани с помощью декальцинирующих жидкостей, обладающих свойствами растворять неорганические соли, не повреждая структурные элементы кости.
При декальцинации следует придерживаться следующих основных правил:
- применять большое количество декальцинирующей жидкости и сменять ее ежедневно (объем жидкости должен превышать объем объекта не менее чем в 50—70 раз);
- декальцинируемый объект помещать в верхнем слое жидкости, чтобы обеспечить опускание на дно растворяющихся солей (подвешивание кусочков на нитке или в стеклянном сите);
- проводить декальцинацию до полного удаления минеральных солей (но не передерживать материал в жидкостях, так как это приводит к набуханию фибрилл и ухудшению окрашиваемости структур).
Декальцинация считается полной тогда, когда объект становится мягким и режется ножом легко и без хруста. Ход процесса можно проверять по степени погружения в объект препаровальной иглы. Сгибать препарат и надавливать на него не рекомендуется, так как это приводит к повреждению тонких структур кости.
Декальцинация в водном растворе азотной кислоты (5—7,5%) является наиболее распространенным способом. Для приготовления рабочего раствора в мерную посуду наливают 5—7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и доливают до 100 мл дистиллированной водой (раствор можно готовить впрок в больших количествах, рассчитав общую потребность). Применять более низкие и более высокие концентрации раствора для декальцинации кости не рекомендуется, так как первые вызывают набухание, а вторые — повреждение клеточных структур. Более высокие концентрации (до 10%) используют лишь для декальцинации зубов.
Налив нужное количество жидкости в подходящий стеклянный сосуд, в нее подвешивают подготовленный к декальцинации кусочек кости. Раствор сменяют ежедневно до наступления полной декальцинации. Срок декальцинации зависит от свойств объекта (плотность, величина) и концентрации азотной кислоты. Средняя продолжительность декальцинации небольших кусочков компактной костной ткани 10—12 сут.
По окончании декальцинации для устранения набухания волокнистых структур препарат подвешивают на 24 ч в 5% раствор сульфата натрия или лития (в случае отсутствия таких солей кость следует поместить в 96% спирт) и лишь после этого тщательно промывают в течение 1—2сут в проточной водопроводной воде.
Можно сократить срок получения декальцинированной кости, поместив выпиленный кусочек непосредственно в 5% раствор трихлоруксусной кислоты, содержащий 10—20% формалина. Эта смесь одновременно фиксирует и декальцинирует. Маленький кусочек средней плотности можно декальцинировать за 3—5 дней. После декальцинации промывают в спирте (ни в коем случае не в воде!).
Существует ряд других способов декальцинации, но все они основаны на одном и том же принципе и требуют соблюдения изложенных выше общих правил.
После декальцинации костную ткань можно резать на замораживающем микротоме, а также заливать в целлоидин или целлоидин-парафин обычным путем. Заливка в парафин не рекомендуется, так как он плохо пропитывает декальцинированную кость.
В настоящее время отечественная промышленность начала выпускать специальный микротом санного типа, позволяющий резать кость без предварительной декальцинации, получая срезы толщиной 20—50 мкм.
Окрашивание
Наиболее распространенный метод окрашивания срезов декальцинированной костной ткани — по Шморлю (тионинпикриновая кислота). Рабочие растворы: А — насыщенный раствор тионина в 50%спирте, Б— 1% водный раствор фенола, В — насыщенный раствор пикриновой кислоты.
Перед употреблением сливают 1 часть раствора А с 10 частями раствора Б. Находящиеся в воде срезы переносят на 10 мин в полученную смесь, после чего споласкивают в дистиллированной воде и помещают на 30—60 с в насыщенный раствор пикриновой кислоты. Затем срезы вновь споласкивают в дистиллированной воде и дифференцируют в 70° спирте до получения темно-красной окраски. После этого их переносят в 96° спирт, в котором продолжают дифференцировку (под контролем в микроскоп) до тех пор, пока общий фон среза не приобретет коричневый4 (или болотный) цвет, а костные клетки и их отростки — красный. Окрашенные срезы затем проводят через 96% и абсолютный спирт, карбол-толуол, толуол и заключают в бальзам.
Если срез плохо окрашивается из-за длительной декальцинации в азотной кислоте, его нужно предварительно поместить на 2—3 ч в 0,5% аммиачную воду, после чего хорошо промыть в дистиллированной воде и затем окрасить.
