Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов - основы гистологии
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов (гликозаминогликанов)
Убедительные данные о наличии кислых мукополисахаридов можно получить при совокупном применении следующих методов.
Выявление кислых мукополисахаридов по методу Гале (Хейла) (свежезамороженные срезы, фиксаторы — формалин, жидкость Карнуа- заливка в парафин). Раствор коллоидного железа. В 100 мл кипящей дистиллированной воды влить при помешивании 8—12 мл 10% раствора хлорида железа, цвет раствора меняется от коричневого до темно-красного. Для удаления из него НС1 производят диализ.
Раствор уксусной кислоты — 2М.
Подкисленный раствор гексациано-феррата (2) калия — желтой кровяной соли и НС1.
Метод. 1. Срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
- Слить равные объемы диализованного хлорида железа и 2М раствора уксусной кислоты. Поместить срезы в этот раствор на 10—15 мин.
- Тщательно промыть в нескольких порциях дистиллированной воды.
- Обработать свежеприготовленным раствором желтой кровяной соли в течение 10 мин.
- Ополоснуть в дистиллированной воде.
- Докрасить ядра одним из ядерных красителей (квасцовый кармин, гематоксилин и др.).
- Обезводить, просветлить, заключить в бальзам.
Результат. Кислые мукополисахариды окрашены в синий цвет, ядра — в красный.
Выявление кислых мукополисахаридов альциановым синим по Стидмену (фиксаторы — Карнуа, Буэна, формалин- заливка в парафин). Метод основан на образовании химических связей между кислотными группами кислых мукополисахаридов (гликозаминогликанов) с альциановым синим. Применяют для выявления муцинов эпителия и соединительной ткани.
Приготовление раствора альцианового синего. 0,1 г красителя растворить в 100 мл 3% уксусной кислоты и отфильтровать.
Метод. 1. Срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
- Окрасить в свежеотфильтрованном растворе альцианового синего в течение 10—30 с.
- Промыть в дистиллированной воде.
- Окрасить гемалауном Эрлиха в течение 5—10 мин.
- Дифференцировать в 1% растворе спирта.
- Промыть в проточной воде 10—20 мин.
- Обезводить, просветлить, заключить в бальзам.
Результат. Кислые мукополисахариды сине-зеленого цвета, ядра — темно-синие или темно-красные.
Методы, основанные на метахромазии. Метахромазия — это такое окрашивание тканей, когда в результате химической реакции ткань — краситель цвет окрашенных структур значительно отличается от исходного цвета красителя.
Практически под метахромазией принято подразумевать явления, наблюдающиеся при использовании красителей тиазиновой группы.
Выявление метахромазии при помощи толуидинового синего (свежезамороженные или фиксированные формалином срезы, парафиновые срезы). 1. Срезы толщиной 5—7 мкм довести до воды.
- Поместить на 4—6 ч в 0,5% водный раствор толуидинового синего.
- Ополоснуть в дистиллированной воде.
- Для гистохимических целей немедленно исследовать в воде.
Результат. Метахроматические вещества красные, розовые (у-метахромазия) или пурпурные (р-метахромазия).
Существуют основанные на метахромазии методы получения постоянных препаратов.
Дифференцировка кислых мукополисахаридов
Кислые мукополисахариды, как правило, не дают положительной ШИК-реакции, но окрашиваются альциановым синим, коллоидным железом и дают метахроматическое окрашивание.
Кислые мукополисахариды разделяют на несульфатированные (гиалуроновая кислота и хондроитин) и сульфатированные (хондроитинсульфата А, В, С, кератосульфат, гепаринсульфат, гепарин).
Обработка гиалуронидазой. Одни депарафинированные и доведенные до воды срезы (контрольные) инкубируют при 37°С в растворе тестикулярной гиалуронидазы, приготовленном на изотоническом растворе хлорида натрия (1 мг фермента на 1 мл раствора) в течение 3 ч, другие — в чистом изотоническом растворе хлорида натрия (при тех же условиях). Затем все срезы окрашивают одним из методов на кислые мукополисахариды. Отсутствие окраски в контрольных срезах и наличие в остальных свидетельствуют о том, что в тканях находится гиалуроновая кислота и хондроитинсульфат С и А.
Если вместо тестикулярной гиалуронидазы применить бактериальную (фермент действует более мягко), то можно отдифференцировать гиалуроновую кислоту.
Реакция метилирования. Деперафинированные контрольные срезы помещают из воды в 0,1N раствор хлористоводородной кислоты в абсолютном метаноле и инкубируют при 58°С в течение 2—3 ч. Затем вместе с остальными срезами окрашивают или альциановым или толуидиновым синим. Отсутствие окраски в контрольных срезах и наличие в остальных свидетельствуют о том, что в исследуемых тканях находятся сульфатированные мукополисахариды (метилирование привело к их десульфатированию).
