Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим - основы гистологии
Фиксацию материала производят после окрашивания, поэтому все рабочие растворы как для окрашивания, так и для фиксации должны быть приготовлены заранее.
Рабочие растворы
Прежде всего приготавливают концентрированный 1 % раствор метиленового синего. В 100 мл жидкости Рингера — Локка растворяют 1 г метиленового синего. Раствор можно сохранять длительное время. Для окрашивания его разводят жидкостью Рингера—Локка в несколько раз.
Жидкость Рингера — Локка подобно изотониче9кому раствору хлорида натрия включает вещества, содержащиеся в тканях животных. При работе с млекопитающими можно употреблять жидкость Рингера — Локка следующего состава.
Хлорид натрия | 6 г |
Хлорид калия | 0,25 г |
Хлорид кальция | 0,25 г |
Бикарбонат натрия | 0,25 г |
Глюкоза | 1 г |
Дистиллированная | |
вода | 1000 мл |
Если имеется соответствующее оборудование, то жидкость Рингера — Локка перед опытом можно насытить кислородом, что улучшает прижизненное окрашивание нервных элементов.
Для приготовления раствора красителя необходимо пользоваться химически чистым кристаллическим метиленовым синим, представляющим собой двойную хлорцинковую соль, или же употреблять медицинский химически чистый метиленовый синий, лишенный хлорида цинка.
Для фиксации материала употребляют растворы пикрата аммония или молибдата аммония. Употребляют только кристаллический молибдат аммония (5—7 г этой соли растворяют в 100мл дистиллированной воды, после чего раствор фильтруют).
Пикрат аммония растворяют в количестве примерно 1 г на 100 мл подогретой (до 60°С) дистиллированной воды. Готовить раствор надо непосредственно перед опытом. Используют только красный изомер этой соли. Для этого 25% раствор аммиака нагревают на водяной бане (в вытяжном шкафу!) и затем небольшими порциями добавляют кристаллическую пикриновую кислоту до тех пор, пока раствор не станет насыщенным (т. е. пока растворение не прекратится). При дальнейшем нагревании на поверхности раствора появляется тонкая пленка из мельчайших кристаллов. После этого нагревание прекращают. Охлаждение надо проводить медленно (на водяной бане или закутать колбу полотенцем). Через 12 ч сливают жидкость, а образовавшиеся кристаллы пикрата аммония сразу же растворяют в дистиллированной воде до получения насыщенного раствора (с сухим пикратом аммония надо обращаться с большой осторожностью, так как при сильном встряхивании и нагревании может произойти взрыв). Дистиллированную воду добавляют с таким расчетом, чтобы на дне оставалось достаточное количество кристаллов, т. е. раствор был насыщенным. Перед употреблением оба раствора охлаждают до 3—5 С. По использовании раствора вновь добавляют дистиллированную воду до насыщения.
Окрашивание
Приводим методику, разработанную А. С. Догелем. Имеются различные способы введения красителя в орган, нервные элементы которого предполагается выявить. Раствор метиленового синего вводят через кровеносные сосуды или же вырезанный из организма орган непосредственно помещают в раствор красителя. Существуют и другие способы: в полость тела (грудную, брюшную) делают инъекцию красителя, при которой прежде всего окрашиваются нервные элементы серозных оболочек, а затем (когда метиленовый синий поступит в кровь) и других органов. Краситель вводят непосредственно в ткань исследуемого органа. Двумя первыми методами пользуются чаще.
Усыпив животное с помощью наркоза, необходимо обнажить крупный артериальный сосуд, ближайший к тому органу, нервные элементы которого окрашивают. Например, если нужно выявить нервные элементы нижней конечности, обнажают брюшную аорту несколько выше ее бифуркации, при инъекции области головы — сонную артерию на шее и т. д. У мелких животных (крысы, морские свинки, крольчата, котята) канюлю вставляют непосредственно в аорту. Сосуд берут на лигатуру около места инъекции (ближе к сердцу) и перевязывают. Надрезав сосуд, вставляют в него канюлю соответствующего размера и укрепляют ее лигатурой. Резиновой трубкой (снабженной зажимом) канюлю соединяют с сосудом, в который налита жидкость Рингеля—Локка, нагретая до температуры 37°С. Перед тем как ввести канюлю, необходимо, пользуясь зажимом, заполнить жидкостью всю трубку и канюлю. Сосуд с жидкостью Рингера — Локка укрепляют примерно на 70 см выше уровня канюли, открывают зажим и пропускают в сосуд промывную жидкость . Если такую установку для промывания (и последующего введения красителя) собрать нельзя, то раствор Рингера — Локка и метиленовый синий можно вводить в сосуд шприцем, соединив его резиновой трубкой с канюлей.
Таким образом после промывки инъецируют и раствор метиленового синего, подогретый до температуры тела животного (из расчета 15 мл 1% раствора метиленового синего на 1 л жидкости Рингера — Локка). Время инъекции красителя надо определить опытным путем. Для этого кусочки ткани из инъецируемой области зажимают между двумя предметными стеклами и при слабом увеличении микроскопа контролируют ход окраски нервных элементов. Обычно время окраски не превышает 40—50 мин. После того как инъекция закончена, орган вскрывают и в течение 2—3 мин оставляют на воздухе (в присутствии кислорода окраска нервных элементов усиливается).
Затем небольшие кусочки органа вырезают и помещают в термостат при температуре 37°С для докрашивания. Для этой цели на дно чашки помещают фильтровальную бумагу, смоченную тем же раствором красителя, который применяли для инъекции, и на поверхность объекта по каплям наносят раствор красителя. Зажав небольшой кусочек органа между двумя предметными стеклами, контролируют ход окрашивания под микроскопом.
Можно производить окрашивание путем погружения органа в краситель. Этот способ чаще применяют при работе с тонкими органами, такими, как стенки полых внутренних органов. Кусочек органа вырезают, расправляют, помещают |в чашку Петри на фильтровальную бумагу, а затем заливают раствором метиленового синего в жидкости Рингера — Локка. Также проводят контроль хода окрашивания под микроскопом.
Фиксация и заключение
После окрашивания метиленовым синим нужно немедленно фиксировать объект, поэтому важно заранее приготовить и охладить фиксирующую жидкость. Фиксацию проводят при температуре 1—3°С. Время фиксации зависит от величины объекта. Для тонких пленок время фиксации раствором молибдата аммония составляет 30 мин — 1ч, раствором пикрата аммония — 2—3 ч. Более толстые объекты фиксируют 12—24 ч.
В некоторых случаях употребляют двойную фиксацию: в течение 30—40 мин фиксируют раствором пикрата аммония, а затем на 1 сут переносят в раствор молибдата аммония.
После фиксации необходимо тщательно промыть кусочки в дистиллированной воде, которую сменяют 5-6 раз, чтобы удалить кристаллы фиксирующих солей. Затем их быстро проводят через 96° и абсолютный спирт, ксилол и заключают в бальзам. Если необходимо приготовить срезы, то заливают в целлоидин. Парафиновая заливка возможна только при описанной выше последовательной фиксации обеими солями. Пленчатые препараты и срезы можно докрасить каким-либо ядерным красителем, например квасцовым кармином. Окрашенные в синий цвет нервные элементы отчетливо видны на фоне окружающих клеток, ядра которых окрашены в красный цвет.
Освоение методики суправитального окрашивания метиленовым синим также лучше начинать с таких объектов, в которых выявление нервных элементов наиболее просто и демонстративно.
Для этой цели можно рекомендовать нервные узлы кишечной сменки лабораторных животных (лучше всего удается окрашивание нервных элементов молодых кошек и собак).
