Окрашивание ткани по методу ван-гизона, маллори - основы гистологии
Окрашивание соединительной и мышечной ткани по методу ван Гизона
Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с окраской гематоксилин-эозином, так как по-разному окрашиваются различные компоненты ткани. При окраске по методу ван Гизона употребляются два раствора: а железный гематоксилин Вейгерта (приготовление см. ниже) и б) вместо эозина кислую смесь пикрофуксина. Коллагеновые волокна соединительной ткани после окраски пикрофуксином имеют ярко-красный цвет, а мышечные и эластические волокна — буровато-красный или желто-зеленый. Железный гематоксилин Вейгерта окрашивает Ядра в темно-коричневый или буровато-черный цвет. Можно подкрашивать ядра и крепким раствором гематоксилина Бемера (без дифференцировки).
Рабочие растворы
Гематоксилин Вейгерта готовят непосредственно перед окрашиванием, смешивая равные объемы основных растворов Вейгерта (первого и второго), которые хранят отдельно.
Первый раствор Вейгерта: в 100мл 96% спирта растворяют 1 г гематоксилина- второй раствор: 4 мл 29% раствора хлорида железа (3 + )* сливают с 1 мл крепкой хлористоводородной кислоты и добавляют 95 мл дистиллированной воды.
*При отсутствии хлорида железа (3+) можно пользоваться 2—3% раствором железоаммониевых квасцов.
При смешивании растворов приливают второй раствор к первому не в равном, а в несколько меньшем количестве, а затем добавляют второй раствор к полученной смеси по каплям из пипетки до равного количества с первым раствором.
В силу изменения поверхностного натяжения раствора он начинает подниматься по стенкам сосуда (бюкса) и собирается в капли, которые вновь стекают в жидкость. Такое явление указывает на правильное количественное соотношение первого и второго растворов Вейгерта в смеси, и тогда добавление второго раствора надо прекратить. Краситель, если он правильно приготовлен, темно-фиолетового цвета. Если он бурого цвета, то имеется избыток второго раствора. Ядра таким красителем будут окрашиваться не в черный, а в бурый цвет.
Растворы Вейгерта в отдельности можно хранить годами, их смесь —не больше 3—4 дней, поэтому лучше всего пользоваться свежим раствором.
Раствор пикрофуксина: к 100мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты прибавляют 4-10 мл 1% водного раствора кислого фуксина.
Если нужно срочно приготовить очень небольшое количество раствора, то в пузырек из-под пенициллина наливают профильтрованный насыщенный раствор пикриновой кислоты (половину пузырька) и к нему по каплям прибавляют 1% раствор кислого фуксина. При этом контролем может служить капля смеси на фильтровальной бумаге, которая должна иметь цвет свежей крови.
Окрашивание
- Из дистиллированной воды срезы перенести в гематоксилин Вейгерта на 2—5 мин. Окраску ядер надо контролировать под микроскопом.
- Ополоснуть срезы в дистиллированной воде и перенести в водопроводную воду на 10 мин (воду нужно сменить).
- Поместить срезы на 1—2—3 мин (иногда на Vi мин) в пикрофуксин.
- Быстро (5—10с) сполоснуть срезы в дистиллированной воде, провести их очень быстро через 96% спирт (можно сменить), просветлить в карбол-толуоле, толуоле и заключить в канадский бальзам. Результат: коллагеновые волокна ярко-красного цвета, а мышечные и эластические — буровато-желтого или желто-зеленого. Ядра бурокоричневого или буро-черного цвета.
Особенности окраски.
Необходим постоянный контроль под микроскопом. Если ядра приобретают бурый, а не черный цвет, то следует дольше подержать срезы в гематоксилине или меньше в пикрофуксине, так как пикрофуксин обладает сильно дифференцирующим действием в отношении гематоксилина.
Если волокна соединительной ткани окрашиваются в интенсивно красный цвет, то следует после пикрофуксина подольше прополаскивать срезы в воде, где кислый фуксин растворяется. Если, наоборот, соединительная ткань бледно окрасилась фуксином, необходимо очень быстро ополоснуть срезы в воде или даже не ополаскивать совсем и сразу перенести в спирты.
Если получается слабая окраска пикриновой кислотой (клетки желез, гладкие мышцы), то необходимо ускорить проводку со спиртами, так как они извлекают из препарата пикриновую кислоту. При перекрашивании препарата пикриновой кислотой необходимо увеличить время пребывания среза в спиртах.
Существенным недостатком этого метода является выцветание препаратов, поэтому их нельзя хранить длительное время. Можно использовать гематоксилин Майера, Караци, Эрлиха, но гематоксилин Вейгерта дает лучшую окраску.
Окраска соединительной ткани по методу Маллори
Окрашиваются парафиновые и целлоидиновые срезы.
Метод хорошо выявляет различные элементы соединительной ткани, особенно коллагеновые и ретикулиновые волокна. Его можно использовать и для окрашивания мышечной и других тканей.
Материал лучше фиксировать в сулемовых фиксаторах, особенно в смеси Ценкера.
Если материал зафиксирован в формалине, то перед окрашиванием срезы следует помещать в жидкость Ценкера на 15—30 мин. Затем на несколько минут срезы погружают в спиртовой раствор йода, что позволяет освободить срезы от осадков дихлорида ртути. После этого срезы помещают в 0,25% раствор тиосульфата натрия (гипосульфита), чтобы восстановить йод.
Рабочие растворы
Необходимо иметь три рабочих раствора.
Водный раствор кислого фуксина 0,1%.
Раствор фосфорно-молибденовой кислоты 1%.
Смесь,состоящая из анилинового синего, оранжевого Г и щавелевой кислоты. Для приготовления красящей смеси 0,5 г анилинового синего, 2 г оранжевого Г и 2 г щавелевой кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Эту смесь нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют. Когда составные части растворяются, смесь приобретает интенсивно коричневый цвет с зеленоватым оттенком. Раствор пригоден к употреблению сразу после приготовления. После долгого хранения перед употреблением раствор необходимо прокипятить и профильтровать.
Окрашивание
- После освобождения от парафина срезы из дистиллированной воды переносят в раствор 0,1% кислого фуксина на 2—3 мин.
- Быстро промывают в дистиллированной воде 1-2 мин.
- Для закрепления, окраски кислым фуксином срезы переносят в 1% раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 3—5 мин.
- Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.
- Переносят срезы в свежепрофильтрованную смесь анилинового синего, оранжевого Г и щавелевой кислоты на 1 мин (следует избегать перекрашивания).
- Промывают срезы в дистиллированной воде.
- Дифференцируют в 96% спирте 3—5 мин и более, пока под микроскопом не появятся окрашенные в синий цвет коллагеновые волокна.
- Проводят через абсолютный спирт, ксилол, заключают в канадский бальзам.
Результат.
Коллагеновые и ретикулиновые волокна темно-синего цвета, слизь — синего, эритроциты — красно-оранжевого, мышечные волокна — ярко- оранжевого, хроматин — красного с желтоватым оттенком, нейроглия и ганглиозные клетки — красновато-фиолетового, секреторный гранулы — красного цвета.
