Приготовление пленчатых препаратов - основы гистологии

Видео: Микробиология. Приготовление временных препаратов (Е. Звонарёва)

Видео: Bioefekts: Микробиологические препараты для с/х

В тех случаях, когда необходимо изучить микроскопическую структуру объекта, имеющего пленчатое строение (серозные и мозговые оболочки, соединительнотканные мембраны и т. д.), приготавливают целостные (тотальные) препараты. Для этого иссекают подлежащий исследованию участок пленки и во избежание образования складок перед фиксацией накалывают в расправленном состоянии на восковую (или пробковую) подушку (см. с. 153).
По окончании фиксации материал обрабатывают обычным способом: отмывают фиксатор, окрашивают, обезвоживают, просветляют и заключают в соответствующие среды.

Прижизненная (витальная) окраска тканей

Описанные в предыдущих разделах методы обработки материала для микроскопического изучения органов и тканей имеют существенный недостаток: перед исследователем всегда статическое состояние объекта, зафиксированное в момент или после прекращения процессов жизнедеятельности. Естественно стремление биологов иметь на вооружении методы, позволяющие вести наблюдения за живыми органами и тканями. Такая возможность открылась с введением в практику методов прижизненной окраски исследуемого объекта.
Основные требования к прижизненным красителям: минимальная токсичность и избирательное окрашивание отдельных структурных элементов клеток и тканей.
Зная особенности распределения в тканях тех или иных красителей при нормальном функционировании организма, можно определить различные отклонения, наступающие при
тех или иных патологических состояниях. Значительную помощь оказывают витальные красители в эмбриологических исследованиях при изучении развития, так как можно успешно вести наблюдения за перемещением окрашенных клеток. Сказанное в полной мере относится и к изучению тканевых культур (выращивание кусочков органов и тканей на специальных питательных средах).
Как и обычные гистологические красители, все красители для прижизненной окраски разделяют на основные, кислотные и нейтральные.
Основные красители воспринимаются почти всеми клетками, но особенно хорошо клетками и структурами, богатыми липоидами. Именно последнее свойство обеспечивает хорошее прижизненное окрашивание основными красителями нервной ткани.
Кислотные красители окрашивают лишь некоторые виды клеток и в первую очередь клетки ретикулоэндотелиальной системы, обладающие высокой фагоцитарной активностью. Эти клетки играют важную роль в защитной реакции организма. Их способность накапливать прижизненно частицы кислотных красителей позволяет широко применять витальное окрашивание для изучения их функционального состояния. К таким красителям относятся трипановый синий, тушь, литиевый кармин.
Существуют различные способы применения витальных красителей. Крупным лабораторным животным красящие растворы вводят путем внутривенных, внутрибрюшинных или подкожных инъекций, причем скорость окраски зависит от способа введения (наибольшая — при внутривенном, наименьшая — при подкожном). Лягушкам краситель вводят в спинной лимфатический мешок или брюшную вену. Окраску мелких водных животных производят подкрашиванием воды в аквариуме.
Применяют также метод введения красителя через рот, подмешивая его в пищу.
Обычно красители растворяют в дистиллированной воде или изотоническом растворе хлорида натрия. Однако самым идеальным растворителем является сыворотка крови соответствующего животного, обеспечивающая лучшее всасывание красителя. Для получения такого раствора в стерильных условиях приготавливают 1% сывороточный раствор соответствующего красителя, центрифугируют его (3000—3500 об/мин) и отсасывают надосадочную фракцию пипеткой.
Освоение техники витального окрашивания наиболее удобно в процессе окраски соединительной ткани белых крыс (или мышей) трипановым синим.
Приготовление раствора. Растворяют 1 г трипановой сини в 100 мл изотонического раствора хлорида натрия (или дистиллированной воды). Годность раствора при хранении в прохладном месте 3—4 нед. Перед употреблением раствор красителя фильтруют, стерилизуют (кипячением в течение 10—15 мин) и дают остыть до 25—35°С. Одновременно стерилизуют двухграммовый шприц и иглы.
Подкожная инъекция. Помощник захватывает корнцангом кожу подопытной крысы на затылке, а второй рукой берет животное за кончик хвоста и растягивает на столе спинкой кверху. Экспериментатор, набрав в шприц раствор красителя (из расчета 0,5 мл на 20 г массы тела), свободной рукой оттягивает кожу на спине (или на боковой поверхности тела животного) и, воткнув под кожу иглу, вводит краситель. 
Введение внутрибрюшинно. Помощник берет крысу так же, как в предыдущем эксперименте, но вытягивает ее вертикально вниз головой. При таком положении тела происходит перемещение органов брюшной полости к диафрагме, что позволяет легко проникнуть в брюшную полость без повреждения внутренностей. Иглу вводят в левую нижнюю половину стенки живота под острым углом (сверху вниз). Способ более быстрый и простой, чем привязывание за лапки в положении на спине. Концентрация и количество красителя те же, что и при подкожном введении.
Внутривенное введение. Можно производить в хвостовую или яремную вены, предварительно привязав крысу в специальном станке брюшком кверху. Количество красителя вдвое меньше, чем при двух предыдущих способах, концентрация та же. При удачной однократной внутривенной инъекции хорошее окрашивание наступает уже через 24 ч, при внутри брюшинной — через 48 ч. Подкожное введение обычно повторяют несколько раз через 3—4 дня. Наступление общего окрашивания легко определить по посинению слизистых оболочек и радужки глаз. Общее посинение кожных покровов наступает несколько позднее.
Животное забивают одним из принятых способов (декапитация, эфир или хлороформ), производят вскрытие и берут подлежащие исследованию органы и ткани.
Фиксация. Фиксация отложившегося в тканях трипанового синего лучше всего наступает при применении сложных фиксаторов — Буэна (с. 165), Штива и др. Однако, если таковые отсутствуют, можно применять и формалин. При этом следует иметь в виду, что нежные гранулы обесцвечиваются, а краситель диффундирует в другие структуры. Пробные препараты можно приготовить из срезов, полученных на замораживающем микротоме. Обычно же материал заливают в парафин, приготавливают срезы толщиной 5—7 мкм и подкрашивают: при применении трипанового синего (или туши) — кармином или нейтральным красным, при применении литиевого кармина — метиленовым синим и др. Затем обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.