Гистохимия нервной системы - основы гистологии

За последние годы в гистологических лабораториях широко применяются нейрогистохимические методы, которые в отличие от классических нейрогистологических методов дают возможность выявить функциональную характеристику элементов различных отделов нервной системы. Наиболее распространенные и доступные из них — это методы определения холинергических и адренергических компонентов.

Метод выявления адренергических компонентов нервной системы

 (метод Фалька — Хилларпа без лиофилизации)*
Метод основан на способности катехоламинов флюоресцировать после обработки парами параформальдегида в проходящем ультрафиолетовом луче. В результате структуры, содержащие катехоламины, светятся желто-зеленым светом. Следует отметить, что данный метод является специфичным не только для нервной системы, но и для других тканей организма, содержащих катехоламины (мозговое вещество надпочечников и др.).

* Данный метод пригоден для выявления адренергических нервных волокон во всех органах, за исключением головного мозга и печени- для работы с этими тканями необходимо после замораживания применение лиофильной сушки кусочков и пропитывание парафином в вакууме.

Приготовление параформальдегида определенной влажности. В зависимости от требуемой влажности параформальдегида на дно эксикатора наливают серную кислоту определенной концентрации. Параформальдегид, находящийся в чашке, выдерживают в эксикаторе на подставке в течение 7—10 дней.
Схема получения параформальдегида определенной влажности

Для большинства органов рекомендуется параформальдегид 60% влажности.
Метод. 1. Кусочки исследуемого органа замораживают сухим льдом.

2. В криостате приготавливают срезы толщиной 15—30 мкм (в зависимости от органа), которые переносят на стекла и высушивают в потоке теплого воздуха в течение 5—7 мин.

3.        Устанавливают стекла в штатив и помещают в стеклянный сосуд объемом 1 л, на дно которого насыпают 5—6 г параформальдегида, имеющего соответствующую влажность, после чего сосуд плотно закрывают и ставят в термостат с температурой +80°С на 60 мин. Срезы извлекают и заключают в жидкий парафин (вазелиновое масло) и исследуют в люминесцентном микроскопе с использованием светофильтров СЗС-14-4, ФС-14, ФС-1-2 и запирающего светофильтра ЖС-18 (до и после просмотра стекла обязательно должны храниться в темноте во избежание угасания флюоресценции).
Для проведения контроля реакции на специфичность часть стекол со срезами нагревают в термостате в стеклянном цилиндре без параформальдегида в тех же условиях.

Метод выявления холинергических компонентов нервной системы (метод Карновского)

В отличие от предыдущего метода, основанного на прямом выявлении катехоламинов в тканях, данный метод базируется на выявлении активности фермента ацетилхолинэстеразы, который катализирует процесс расщепления нейромедиатора ацетилхолина в месте его локализации (нейроцит и его отростки). Выявление структур происходит в результате выпадения окрашенного продукта реакции фермент- субстрат.
Приготовление инкубационной среды
Для приготовления инкубационной среды применяют следующие растворы.

1. а) 0,2М NaOH : 0,8 г NaOH + 100 мл Н2 О. б) 0,2М NaH-малеиновая соль (раствор):

2,32 г малеиновой кислоты + 60,0 мл Н2 О + 0,8 г NaOH и доведение до 100 мл.
Из двух растворов приготавливают первый рабочий раствор: 26,9 мл 0,2М ОН+50,0мл 0,2М NaH-малеиновая соль + Н2О до 200 мл.

1. Цитрат натрия 0,1М : 2,59 г Na3C6H5О7 + 100 мл Н2О.
2. C11SO4 . 6Н2 О : 0,375 г C11SO4 + 50,0 мл Н2О.
3. Красная кровяная соль: 0,083 г K3Fe(CN)6 + 50,0 мл Н2О.

Инкубационную среду готовят перед употреблением, смешивают в указанной ниже последовательности и хорошо встряхивают.
Ацетилтиохолинйодида                                                       10 мг
Кислого малеиновокислого Na                     0,2 М (pH 6,05) 13 мл
Цитрата натрия 0,1 М                                                          1 мл
CuSО4 30 М                                                                       2 мл
Дистиллированной воды                                                      2 мл
K3Fe(CN)6 5 М                                                                    2 мл
В контроле вместо ацетилтиохолинйодида применяют бутирилтиохолинйодид и той же концентрации.
Метод. 1. Кусочки исследуемого органа (размер 3x3 мм) фиксировать в течение 2,5—3,5 ч при температуре + 2— + 4°С в 4% растворе формалина, забуференного до pH 7,6 при помощи 0,075М фосфатного буфера, содержащего 0,044 М сахарозу.

1. Промокнуть и поместить в 0,044 М сахарозу при температуре + 2— + 4°С на 15—16 ч, после чего вновь промокнуть и быстро заморозить сухим льдом.
2. Нарезать срезы в криостате (толщиной 1—30мкм), перенести на стекла, подсушить на воздухе и поместить в инкубационную среду на 60 мин (при температуре +37°С).
3. Перенести стекла со срезами в стаканчик с 10% формалином, приготовленным на изотоническом растворе хлорида натрия, на 10 мин.
4. Ополоснуть в двух порциях дистиллированной воды, подкрасить кармином и заключить, как обычно, в канадский бальзам.

Результат. Холинергические компоненты, цитоплазма нейроцитов и нервные волокна окрашиваются в коричневый цвет, интенсивность которого прямо пропорциональна активности фермента.

Видео: Урок биологии №45. Строение и функции отделов головного мозга.