Фиксирующие средства - основы гистологии
Видео: Базы под тени. В поисках лучшей.
Фиксирующие средства и их применение
Применяемые фиксаторы разделяют на две основные группы: 1) фиксирующие вещества (простые фиксаторы)-
2) фиксирующие смеси (сложные фиксаторы). Существует большое количество тех и других. В настоящем руководстве приводятся наиболее распространенные фиксаторы.
Простые фиксаторы
Формалин (формол). Формалин является самым дешевым и распространенным фиксатором. В чистом виде представляет светлую, сильно пахнущую жидкость, состоящую из 40% водного раствора формальдегида. Применяют преимущественно в виде 10% водного раствора, для чего 1 часть формалина (т. е. 40% раствора формальдегида) разводят 9 частями воды. Приготавливают раствор обязательно на водопроводной воде, так как дистиллированная вызывает набухание тканей. Широкое применение формалин получил благодаря ряду свойств: а) высокой степени диффузии- б) способности хорошо сохранять форму, окраску и структуру исследуемого объекта- в) оказывать длительное фиксирующее действие (до нескольких лет), существенно не ухудшая при этом качество материала- г) хорошо сохранять жиры и липоиды. Высокая диффузионная способность и незначительное осаждающее действие позволяют формалину довольно быстро и глубоко проникать в ткани, что позволяет фиксировать кусочки органа размером от 1 см и более, а при необходимости и довольно крупные органы целиком.
Срок фиксации тканей в формалине 24—48 ч. Обычный формалин, как правило, содержит примесь метилового спирта и муравьиной кислоты, количество которой увеличивается под влиянием света.
При охлаждении формалина в растворе появляется муть, оседающая в виде белого осадка (параформальдегид). Такой же осадок наблюдается на стенках сосуда и при испарении формалина. Поэтому формалин следует хранить в темной плотно закрывающейся стеклянной посуде при температуре не ниже 9°С.
Нейтрализация формалина. Примесь в формалине муравьиной кислоты придает раствору слабокислый характер, что нежелательно при применении ряда методов исследования (некоторые гистохимические реакции, серебрение раствором нитрата серебра). Способ нейтрализации формалина довольно прост: в сосуд засыпают карбонат кальция (или карбонат магния) в таком количестве, чтобы на дне образовался слой толщиной 1,5—2 см. Затем наливают формалин, несколько раз энергично встряхивают и оставляют стоять 24—48 ч. В течение этого времени происходит нейтрализация раствора.
Побочные действия формалина. Длительное хранение препаратов в концентрированном растворе формалина придает тканям чрезмерную плотность, затрудняющую дальнейшую обработку и ухудшающую качество препарата. Устранить этот недостаток можно путем помещения материала на 2 нед в 1% раствор нитрата серебра или 10% раствор лимонной кислоты. Длительное хранение в 10% растворе формалина приводит также к набуханию объекта, что необходимо помнить при его измерении после фиксации.
При фиксации формалином в препаратах нередко появляется темно-коричневый кристаллический осадок — результат взаимодействия формалина с находящимся в тканях гемоглобином. Его удаляют путем помещения неокрашенных срезов в 1—5% раствор аммиака или 70% этиловый алкоголь на различные сроки (от 5 мин до 4 ч). Затем препарат тщательно промывают и ведут дальнейшую обработку.
Следует постоянно помнить, что длительное действие паров формалина сильно раздражает слизистые оболочки. Смачивание кожи формалином оказывает дубящий эффект, а при повторных частых контактах вызывает сухую экзему. Поэтому перед препарированием формалиновые препараты помещают в слабоаммиачную воду (для устранения запаха) и работают в резиновых перчатках (при возможности под вытяжным устройством).
Этиловый спирт. Фиксирующее действие осуществляется за счет отнятия у тканей воды и коагуляции белков. Несмотря на ряд отрицательных свойств спирта (сморщивание клеток в результате быстрого отнятия воды, растворение и экстракция жиров и гемоглобина), он как фиксатор находит широкое применение в микроскопической технике. Это объясняется тем, что этиловый спирт осуществляет быструю фиксацию, не требующую обезвоживания тканей перед заливкой в парафин и целлоидин. Будучи химически неактивным веществом, спирт особенно пригоден при гистохимических исследованиях. В нем хорошо сохраняются такие вещества, как муцины, гликоген, мочевая кислота, железо, кальций, которые легко растворимы в других фиксирующих жидкостях.
Чаще применяют 96% и абсолютный этиловый спирт. Некоторые авторы рекомендуют также концентрации 80 и 90%. Время фиксации зависит от материала: для тонких пленок — 15—30 мин, для кусочков толщиной 3—4 мм — 2—4 ч. В связи с тем что спирт легче воды, она, экстрагируясь из тканей, опускается на дно. Поэтому под кусочки исследуемого материала нужно обязательно подкладывать толстый слой ваты. Излишнее пребывание препарата в спирте вызывает чрезмерное уплотнение ткани, что плохо отражается на последующей ее обработке.
Метиловый спирт (метанол). Бесцветная жидкость, в чистом виде напоминает по запаху этиловый спирт, технический же (неочищенный) метанол обладает неприятным запахом, обусловленным примесью других веществ. В микроскопической технике применяют в виде абсолютного, лишенного примесей спирта для фиксации мазков крови. Лучше всего пользоваться метанолом, предназначенным для анализа.
Следует помнить, что метанол является сильным ядом, поэтому требуется соблюдение правил употребления и хранения, предусмотренных для ядовитых веществ группы А.
Ацетон. В последнее время все большее применение в гистологических лабораториях для гистохимических целей находит фиксация ацетоном благодаря простоте, возможности быстрой фиксации и сохранению после нее многих химических соединений, в том числе активности многих ферментов. Недостаток метода —нарушение тонкой цитологической структуры. Применять следует бесцветный (безводный) раствор. Фиксировать можно как кусочки тканей (см. с. 157), так и срезы. Приготовленные в криостате срезы расправляют кисточкой на предметном стекле, переносят в плотно закрытый стаканчик с холодным (5--10%) ацетоном и помещают в баню с сухим льдом или же в камеру криостата. Срок фиксации зависит от толщины срезов (в среднем 5—10 мин можно хранить и несколько дней).
Из других фиксирующих средств следует упомянуть дихлорид ртути (сулема), соли тяжелых металлов (кобальт, платина, уран и т. д.) и кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, осмиевая, хромовая и др.). В чистом виде эти вещества применяют редко, но зато они являются составной частью многих фиксирующих смесей.
Фиксирующие смеси (сложные фиксаторы) и их применение
Жидкость Мюллера. В настоящее время применение ее в чистом виде ограничено. Однако она служит исходным раствором для приготовления таких распространенных фиксаторов, как жидкости Ценкера, Орта, Максимова и др. Состав:
Бихромат калия 2,5 г
Сульфат натрия 1 г
Вода дистиллированная 100 мл
Для лучшего растворения бихромата калия рекомендуется подогревать воду.
Жидкость Ценкера (сулемовая смесь). Один из лучших фиксаторов для приготовления обзорных препаратов и препаратов для ряда тонких гистологических исследований. Обеспечивает хорошую окрашиваемость тканей. Состав и способ употребления:
Жидкость Мюллера 100 мл Дихлорид ртути (HgCl2) 5 г Уксусная кислота ледяная 5 мл
(прибавляется непосредственно перед употреблением- может быть заменена равным количеством формалина по Гелли).
Толщина фиксируемых кусочков не должна превышать 5 мм. Время фиксации 1—24 ч в зависимости от толщины и свойств объекта.
Последующая обработка. После тщательного промывания в проточной воде в течение 20—24 ч (вода должна стать бесцветной) кусочки помещают в 70% йодированный спирт для удаления из тканей осадков дихлорида ртути. С этой целью к 70% спирту прибавляют несколько капель 90% спирта, содержащего в 100 мл 2 г йода и 3 г йодида калия, до получения раствора цвета крепкого чая. Отмывание дихлорида ртути ведут в нескольких порциях йодированного спирта, меняя его через 18—24 ч до прекращения просветления (растворение осадка дихлорида ртути обесцвечивает спирт).
После фиксации жидкостью Ценкера рекомендуется заливка в целлоидин или целлоидин-парафин, так как заливка в парафин приводит к значительному сжатию и сморщиванию тканевых структур.
Жидкость Максимова (ценкер-формол). Фактически представляет собой видоизмененную жидкость Ценкера, в которой ледяная уксусная кислота заменена формалином. Фиксатор широко применяют для гематологических исследований. Дает хорошее окрашивание клеток крови и позволяет выявлять их специфичную зернистость.
Видео: КОЖА ПАЛЬЦА ТОЛСТАЯ КОЖА SKIN гистологическое строение
Состав и способ употребления:
Жидкость Мюллера
Бихромат калия 2,5 г
Сульфат натрия 1 г
Вода дистиллированная 100 мл
Дихлорид ртути 5 г
Формалин 10 мл
Время фиксации 6 ч. Толщина кусочков не больше 5 мм. Дальнейшая обработка и заливка те же, что и после фиксации в жидкости Ценкера.
Если к жидкости Максимова добавить 10 мл 2% раствора осмиевой кислоты и увеличить время фиксации до 24 ч, можно одновременно получить осмирование жира.
Примечание. Дихлорид ртути является сильнодействующим ядом, поэтому употребление и хранение реактива требуют соблюдения правил, предусмотренных для веществ группы А.
Фиксация по Навашину—Крылову. Фиксация этим методом дает хорошие результаты при окраске ядер и протоплазматических структур железным гематоксилином. Состав фиксатора Навашина:
Хромовой кислоты 1 % раствор 10 мл
Формалин 10% 10 »
Вода дистиллированная 90 »
Уксусная кислота ледяная (добавляют непосредственно перед фиксацией) 2 »
Кусочки толщиной 5 мм следует фиксировать 4—6 ч- затем тщательно промыть в проточной воде (24—36 ч) для удаления хромовой кислоты, остатки которой ухудшают окраску препаратов.
Г. И. Крылов предложил перед промывкой проводить кусочки через несколько порций 5—10% формалина до прекращения желтого окрашивания раствора (формалин извлекает хромовую кислоту из тканей). Эта процедура сокращает сроки промывания в воде.
Жидкость Буэна. Является одним из лучших фиксаторов. Относительно быстро проникает в ткани, вызывая незначительное (на 2,5%) их сжатие. Очень хорошо окрашивает тканевые структуры. Применяют как для обзорных препаратов, так и для тонких исследований, а также для фиксации эмбрионов.
Состав:
Раствор пикриновой кислоты насыщенный 75 мл
Формалин 25 »
Уксусная кислота ледяная 5 »
Сливание перечисленных жидкостей производят непосредственно перед фиксацией. Так как пикриновая кислота плохо растворяется в воде, ее насыщенный раствор необходимо готовить заранее. В сосуд насыпают 25—30 г кристаллической кислоты и заливают 1 л горячей дистиллированной воды. Избыток кислоты при охлаждении выпадает в осадок и может быть использован при приготовлении новой порции раствора. Раствор можно хранить неограниченно долго.
Продолжительность фиксации материала 2—24 ч в зависимости от величины объекта. Однако и более длительное (до нескольких суток) пребывание кусочков в фиксаторе не ухудшает качество фиксации и последующей обработки.
После фиксации материал переносят в 70—80% спирт (для удаления пикриновой кислоты), который меняют 1-3 раза. Производят заливку в парафин.
Примечание. Объект, фиксированный в жидкости Буэна, не пропитывается полностью целлоидином.
Жидкость Карнуа. Служит хорошим фиксатором как для гистологических исследований (ядра), так и для многих гистохимических методик (нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды). Недостатком является легкое сморщивание цитоплазмы и соединительной ткани.
Состав:
Этиловый спирт абсолютный 60 мл (при отсутствии можно заменить
96% спиртом)
Хлороформ 30 »
Уксусная кислота ледяная 10 »
Жидкость Карнуа приготавливают перед фиксацией. Кусочки толщиной до 5 мм фиксируют в течение 1—5 ч (в зависимости от толщины объекта). После фиксации кусочки сразу переносят в абсолютный спирт (если фиксатор был приготовлен на 96% спирте, то кусочки следует ополоснуть 2—3 раза в 96% спирте, где в случае необходимости можно оставить их на 2—3 ч).
Примечание. Надо следить, чтобы материал находился в фиксаторе не дольше, чем это нужно для полного его пропитывания, так как удлинение фиксации усиливает сжатие и уплотнение объекта.
Фиксатор ФСУ (формалин, спирт, уксусная кислота) Бродского.
Рекомендуется для изучения структуры тканей и количественного цитохимического анализа нуклеиновых кислот. Преимущество ФСУ перед фиксатором Карнуа в том, что формалин подавляет активность ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты (нуклеазы) в фиксируемых клетках, благодаря чему количественно лучше сохраняются ДНК и РНК.
Состав и способ употребления:
Формалин нейтральный неразведенный 3 части
Спирт этиловый 96% 1 часть
Уксусная кислота ледяная 0,3 части
Кусочки тканей 2x2 или 2x3 мм- время обработки 1-4 ч в зависимости от свойств объекта.
После фиксации кусочки промыть водой в течение 12 ч или (для цитохимических целей) в течение того же времени тремя сменами 70% спирта. Быстро обезводить и залить в парафин.
Фиксатор Шабадаша. Рекомендуется как лучший фиксатор для гистохимического выявления гликогена (особенно, где его мало, —центральная нервная система).
Состав:
Кусочки органа (не более 3x3 мм) фиксировать 3 ч в первом растворе, затем перенести во второй раствор на 3 ч. Промыть в трех-четырех сменах 70% спирта по 2 ч. Залить в парафин или целлоидин.
