Импрегнация элементов макроглии - основы гистологии

Импрегнация элементов макроглии (астроцитов)
Лучшим методом является импрегнация астроцитов хлоридом золота по методу Кахаля. Фиксацию материала проводят в 12% растворе формалина или лучше в специальном бромистом фиксаторе, состоящем из 14 мл формалина (крепкий нейтральный), 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды.

Фиксация длится 2—8 дней (не дольше). Затем необходима промывка в водопроводной воде и резка на замораживающем микротоме. Толщина срезов 20—30 мкм. Прямо с микротомного ножа срезы переносят снова в бромидный фиксатор и в течение 2 сут выдерживают в термостате при 37 °С. После этого быстро промывают в дистиллированной воде и переносят в импрегнирующую смесь следующего состава.
Раствор хлорида золота
1%                                                      10 мл
Раствор дихлорида ртути кристаллической 5%     8 мл
Дистиллированная вода 50 мл
Смесь должна быть свежеприготовленной и находиться в посуде из темного стекла.
В этой импрегнирующей смеси срезы выдерживают 2-8 ч. Срезы должны лежать свободно, в расправленном состоянии.
Для этого необходимо в 25 мл смеси класть не больше 5-8 срезов. В процессе импрегнации срезы становятся коричневыми с красноватым оттенком. Если импрегнация будет слабая, можно держать срезы в этом растворе сутки и больше.
Для фиксации металлического золота в структурах срезов последние помещают в 10% раствор тиосульфата натрия на 15—20 мин, где срезы становятся бледнее и принимают фиолетовую окраску. Затем их промывают в 40—50% спирте, быстро проводят через абсолютный спирт, ксилол и заключают в бальзам. Метод, как правило, надежен. Неудачи могут зависеть от плохой фиксации или загрязненности реактивов. Оптимальная температура для импрегнации 20°С.
Результат. Астроциты с отростками краснофиолетового, серо-фиолетового или коричневого цвета.

Импрегнация элементов микроглии по В. К. Белецкому

Дает возможность импрегнировать также гистиоциты не только мозга, но и печени, подкожной клетчатки, адвентициальные клетки капилляров и т. д.
Метод основан на импрегнирующей способности аммиаката серебра. Необходимо соблюдать все условия, о которых говорилось выше при описании метода Бильшовского—Грос в модификации Б. И. Лаврентьева (чистота реактивов и посуды).
Фиксация материала: 10% раствор формалина, лучше нейтрального (до 5 дней). Материал, фиксированный недлительно, импрегнируется лучше, чем старый.
После фиксации материал необходимо хорошо обмыть в проточной водопроводной воде (24 ч), а затем в дистиллированной (30 мин). Далее материал можно: 1) не заключая, резать на замораживающем микротоме- 2) заключить в желатин- 3) заключить в целлоидин.
Необходимо отметить, что наилучшие результаты дает метод с заключением в желатин (карболовый или простой), но при известном навыке получают хорошие препараты и без заключения. Срезы делают на замораживающем микротоме (толщина срезов 10—20 мкм) и проводят через дистиллированную воду.
Для импрегнации необходимо иметь свежеприготовленный 10% раствор нитрат-аммиаката серебра и 10% раствор нейтрального формалина.
Работу проводят в четырех широких бюксах. В первый наливают 10% раствор аммиаката серебра, во второй — дистиллированную воду, в третий — 10% раствор нейтрального формалина, в четвертый — дистиллированную воду. Срезы переносят из дистиллированной воды в первый бюкс с аммиакатом серебра на 20—30 с, затем в дистиллированную воду (второй бюкс) на 1 с и после этого — в третий бюкс (с формалином). Все эти манипуляции делают быстро, чтобы срез не лежал в воде более 2 с. Серебро в формалине должно медленно восстанавливаться: срез сначала темнеет, затем становится серо-желтым или коричнево-желтым. Затем срезы помещают в четвертый бюкс с дистиллированной водой, откуда их вылавливают на предметное стекло и рассматривают при слабом увеличении микроскопа.
При слабой импрегнации следует дольше (часами) выдерживать срезы в формалине в последнем бюксе. Если гистиоциты совсем не выявились, надо отметить, какие структуры видны на срезе. Можно употреблять горячий формалин: он быстро восстанавливает серебро. Если срезы белые (белые пятна) или слегка желтые и если в них видны лишь отдельные ядра либо вообще структур не видно, значит, материал «кислый». В этом случае срезы перед импрегнацией нужно положить на 20— 30 мин (можно до 1 сут в зависимости от степени кислотности) в аммиачную воду (3—4 мл аммиака на 50 мл воды) и после промывки проводить импрегнацию.
На срезе могут осаждаться гранулы (зерна) или хлопья серебра и выявляться много ядер, это означает, что условия импрегнации слишком «кислые» для данного материала. Этого можно избежать: а) увеличением времени импрегнации в нитрате серебра- б) ощелачиванием раствора нитрата серебра. Зная, что при полном растворении всего осадка нитрата серебра аммиаком раствор получается слабощелочной, можно увеличивать щелочность раствора, приливая по каплям аммиак, или уменьшать щелочность, прибавляя по каплям 1% раствор нитрата серебра- в) подогреванием формалина и уменьшением его концентрации до 1—5%. Срезы по мере необходимости можно опускать в теплый или горячий формалин.
Если срезы в формалине быстро темнеют или даже чернеют, то материал «щелочной». Можно освободить материал от излишней щелочности, помещая срезы перед импрегнацией в 1—2% раствор уксусной кислоты на 15—20 с и более (до 1 сут) в зависимости от степени щелочности. После промывки производят импрегнацию.
Хорошее выявление в срезах волокнистых структур (коллагеновые, ретикулиновые, нервные волокна) означает, что для данного материала условия импрегнации слишком «щелочные». Этого можно избежать: а) уменьшением времени импрегнации- б) разведением раствора нитрата серебра- в) уменьшением щелочности раствора нитрата серебра (см. выше)- г) заменой нейтрального формалина кислым- д) увеличением концентрации кислого формалина до 20%.