Приготовление срезов из парафиновых блоков - основы гистологии
Резание.
Наклеенный на деревянную колодку парафиновый блок прочно закрепляют в зажиме микротома, расположив длинной осью параллельно длиннику микротома. Затем, установив необходимый угол резания и правильный угол наклона ножа, его прочно закрепляют винтовыми зажимами и располагают над блоком. 
Рис: 74.
Техника резания парафиновых блоков.
После этого, регулируя винтами механизм подачи, блок устанавливают таким образом, чтобы верхняя его плоскость находилась в горизонтальном положении и не доходила до лезвия ножа на 0,5—1 мм. Когда предварительная подгонка блока к ножу закончена, устанавливают микрометрическую шкалу на получение толстых (25—30 мкм) срезов и движением ножевых салазок начинают подавать блок вверх до получения с него первых полных срезов. Затем производят моделирование блока: срезают скальпелем избыточный парафин, оставляя вокруг залитого объекта слой не более 2—3 мм, и придают блоку прямоугольную форму. После этого устанавливают микрометрическую шкалу на нужную толщину среза и приступают к окончательной резке материала.
Следует помнить, что перемещение ножевых салазок вдоль рельсового пути нужно производить плавно и без излишних усилий. Нельзя надавливать на рукоятку сверху, так как это приводит к вытеснению слоя масла, находящегося между скользящими поверхностями, и опусканию ножа, вследствие чего срезы получаются неравномерными. Движение микротомным ножом в момент прохождения над блоком надо производить быстро.
Обучающимся лаборантам лучше начинать с приготовления гистологических срезов толщиной 14—16 мкм и лишь постепенно, по мере освоения техники резки, уменьшать толщину срезов.
Правильно залитые небольшие кусочки органов и тканей при оптимальном температурном режиме в помещении режутся хорошо, и срез, как правило, ложится на нож в расправленном состоянии (угол резания прямой). При резке больших блоков и твердого материала срезы часто
закручиваются. Однако этого можно избежать путем придерживания и приподнимания среза кисточкой за передний его край в процессе резки (рис. 74). Нужно следить, чтобы срез не был прижат к ножу, так как при этом происходит его приклеивание и повреждение. Готовый срез осторожно снимают с ножа влажной кисточкой (в направлении от спинки к лезвию) и переносят либо на подготовленное предметное стекло, либо в чашку с теплой (35—40°С) дистиллированной водой. Воду предварительно кипятят, чтобы предупредить появление на нижней поверхности срезов пузырьков воздуха (который может быть растворен в воде), мешающих равномерному приклеиванию срезов к стеклу. Помещают срезы на воду (предметное стекло) обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая).
Рис. 75.
Порядок расположения серийных срезов на стекле.
При резке надо следить, чтобы волоски от кисточки не попадали под режущий край ножа, так как это приводит к повреждению лезвия.
Для ряда исследований необходимо получение серийных срезов. Очень важно не перепутать очередность серийных срезов при наклеивании на предметное стекло. Для этого ленту срезов разрезают скальпелем на отдельные фрагменты длиной около 3/4 предметного стекла и укладывают всегда в определенном порядке вдоль или поперек стекла (рис. 75). В зависимости от величины объекта и размера предметного стекла на одном стекле может разместиться различное количество срезов (от 2—4 до 25—30).
Возможные погрешности при изготовлении парафиновых срезов
Для того чтобы получить хорошие гистологические срезы, необходимо уметь своевременно распознать и устранить причину, ухудшающую качество срезов.
- Срез крошится. Причины: 1) твердый парафин- 2) низкая температура окружающей среды- 3) медленное охлаждение парафина при заливке- 4) большой угол наклона ножа. Устранение: 1) перезалить материал в более мягкий парафин после предварительного растапливания блока в термостате- 2) дышать на поверхность блока (согревание) перед каждым движением ножа или приспособить над блоком электрическую лампочку- 3) изменить угол наклона ножа.
- Залитый материал в процессе резки выпадает из окружающей массы парафина. Причины: 1) при переносе кусочка в формочку для заливки произошло его охлаждение- 2) заливка произведена охлажденным парафином- 3) недостаточное удаление спирта перед пропитыванием. Устранение: в первом и втором случаях необходимо блок растопить в термостате и залить заново, строго соблюдая правила заливки, в третьем случае после предварительного растапливания материал переносят в промежуточные среды (для удаления спирта), затем вновь пропитывают и заливают.
- Плоскость среза неровная, материал плохо режется или совсем не режется, нож подскакивает над поверхностью блока. Причина — переуплотнение материала при проводке и фиксации. Устранение невозможно. Можно лишь несколько размягчить материал, если на поверхность резания перед каждым движением ножа наносить кисточкой слой горячего парафина (дав ему затем остыть) или дышать на поверхность блока.
- Срезы закручиваются, прилипают к поверхности ножа, мнутся. Причины: 1) малый угол наклона ножа- 2) мягкий парафин- 3) высокая температура окружающей среды. Устранение: 1) изменить угол наклона- 2 и 3) перезалить материал в более твердый парафин или охладить блок путем помещения перед резкой в холодильник (можно также положить на поверхность резания кусочек льда).
- Приклеивание, сморщивание или разрыв срезов, особенно при резке органов, богатых костной, хрящевой или плотной соединительной тканью, могут быть следствием их электризации. Устранение: помещать на лезвие (в месте прохождения среза) каплю воды, дышать на лезвие и блок, натирать участок лезвия и прилежащую часть ножа куском твердого парафина.
- Срезы разрываются или покрыты бороздами. Причины: 1) зазубрины на лезвии ножа- 2) грязный парафин (плотные соринки царапают срез и портят лезвие)- 3) материал плохо декальцинирован. Устранение: 1) точка и правка ножа или перемещение в ножедержателе- 2) перезаливка в чистый парафин- 3) устранить нельзя.
- Плоскость среза не однородна (беловатая в средней части). Причина — недостаточное обезвоживание. Устранение: расплавление блока и проведение материала через промежуточные среды до абсолютного спирта. После обезвоживания проводят через промежуточную среду, пропитывают и заливают.
Наклеивание.
Для того чтобы парафиновые срезы можно было подвергнуть дальнейшей обработке, их необходимо наклеить на предметное стекло в расправленном положении. Существует несколько методов наклеивания срезов, но наиболее широко распространено приклеивание при помощи белка с глицерином.
Приготовление раствора.
К белку из свежего куриного яйца добавляют равное по объему количество химически чистого глицерина и хорошо взбалтывают (или взбивают). Приготовленный раствор фильтруют через влажный складчатый бумажный фильтр в чистый флакончик. Во избежание гниения белка к фильтрату добавляют 2—3 маленьких кусочка (с пшеничное зерно) тимола или формалин (1:100). В хорошо закрытом сосуде раствор сохраняется длительное время.
Рис. 76.
Натягивание находящихся на воде парафиновых срезов на предметное стекло.
Подготовку предметных стекол к наклеиванию следует произвести до начала резки парафинового блока на микротоме, поместив на тщательно очищенную поверхность (см. с.146) стеклянной палочкой небольшую каплю раствора белка с глицерином и растерев ее до получения равномерного слоя. Растирание можно производить пальцем (предварительно протерев его ваткой, смоченной эфиром) или тонкой чистой льняной тряпочкой. Приготовив предметные стекла, приступают к резке парафинового блока (см. выше).
Существует несколько способов расправления и наклеивания срезов.
- Если срезы были перенесены для расправления в теплую воду, то смазанное белком с глицерином предметное стекло подводят в наклонном положении под плавающие срезы, натягивают их на стекло с помощью кисточки или препаровальной иглы (рис. 76) и придают им правильное положение. Срезы следует располагать несколько эксцентрично, чтобы один конец предметного стекла был более свободен (при таком размещении остается больше места для нанесения обозначений и требуется меньшее количество реактивов при обработке стекол в стаканчиках). Затем удаляют излишнюю воду (наклонив стекло и осторожно придерживая срезы за парафиновую каемку), кладут стекла на планшеты и помещают в термостат или сушильный шкаф (при 42—45°С) на 24 ч, где и происходит окончательное высушивание и приклеивание срезов. Можно высушивать и при комнатной температуре, предохраняя при этом срезы от запыления, но тогда лучше выдерживать их 36—48 ч.
- Если срезы перенесены с ножа непосредственно на смазанное белком с глицерином предметное стекло, то их можно наклеивать по-разному.
Влажный способ. На стекло с помощью пипетки наносят несколько капель прокипяченной дистиллированной воды и получают плавающие срезы. Затем стекло осторожно подогревают над спиртовкой и добиваются полного расправления срезов. При этом следует избегать перегревания, так как расплавление парафина приводит к повреждению среза.
При определенном навыке степень нагрева довольно легко определить, прикладывая нижнюю поверхность стекла к тыльной поверхности кисти (температура стекла не должна вызывать ощущения жжения). Для этого способа расправления промышленность выпускает специальные электрические приборы «Приспособление для сушки и расправления парафиновых срезов» (ТУ 64—1—38—73).
Значительная рабочая поверхность прибора (250 x375 мм) позволяет располагать на столике одновременно до 45 стекол. Прибор питается от сети переменного тока (напряжение 127 или 220 В). Столик ставят рядом с микротомом. Перед началом резки снимают крышку, включают прибор в сеть. На покрытые белком предметные стекла наносят несколько капель дистиллированной воды, кладут на столик. Сделанный срез кисточкой переносят на стекло. После его расправления удаляют излишнюю воду, вновь кладут стекло на столик до высыхания, после чего стекло со срезом перекладывают на стол и защищают от пыли до окраски.
Сухой способ. Плоской (не слишком мягкой) кисточкой прижимают один край среза к предметному стеклу, затем осторожно проводят по всему срезу, расправляя и раскручивая его. После этого срез прижимают кисточкой к стеклу так, чтобы между его нижней поверхностью и стеклом не оставалось пузырьков воздуха, и быстро подогревают над слабым пламенем спиртовки (не перегревать!). В результате коагуляции белка срез прочно приклеивается к предметному стеклу и может быть сразу подвергнут дальнейшей обработке без подсушивания.
Недостаток сухого наклеивания в том, что тонкие и нежные срезы легко повреждаются и плохо расправляются, поэтому оно применимо далеко не всегда.
В тех случаях, когда нежелательно наличие белковоглицеринового слоя, срезы можно наклеивать с помощью дистиллированной воды или 30% спирта. При этом способе предметные стекла должны быть обезжирены особенно тщательно, так как в противном случае вода неравномерно распределится по стеклу и срез плохо приклеится. Способ наклеивания довольно прост: на стекло наносят воду (или 30% спирт) и на нее кладут срезы блестящей стороной книзу- затем нагревают, расправляют, удаляют воду и сушат, как описано выше.
Качество приклеивания срезов определяют, рассматривая их со стороны стекла, которое держат в наклонном положении. Если срезы кажутся матовыми, то приклеивание хорошее, если имеются участки, отсвечивающие, как зеркало, то между срезом и стеклом находится слой воздуха и в этом месте приклеивание не произошло. Такие срезы при дальнейшей обработке легко соскальзывают со стекла. Обычно воздушная прослойка появляется при недостаточной чистоте предметного стекла или слишком низкой температуре сушильного шкафа. Предотвратить соскальзывание таких срезов можно путем целлоидиновой защиты.
Примечание. Пребывание срезов в теплой воде необходимо сократить до минимума, так как иначе могут произойти набухание соединительной ткани (особенно при фиксации в жидкостях, содержащих трихлоруксусную и пикриновую кислоты), растворение и вымывание некоторых веществ, входящих в состав тканей.
