Приложение - криптоспоридиоз и вич-инфекция
Видео: Международный день борьбы с ВИЧ инфекцией и СПИД. Рязань 01.12.2014. ЭТО ИНТЕРЕСНО.
Лабораторная диагностика криптоспоридиоза
I. Подлежащие обследованию контингенты:
1. Больные с длительно сохраняющимся диарейным синдромом.
2. Пациенты инфекционных кишечных стационаров.
3. Больные ВИЧ—инфекцией с признаками кишечной дисфункции.
4. Лица, контактировавшие с больными криптоспоридиозом и ранее переболевшие (реконвалесценты).
II. Исследуемые материалы:
1. Фекалии больных.
2. Рвотные массы.
3. Мокрота и лаважная жидкость (при подозрении на криптоспоридиоз органов дыхания).
Фекалии собирают в сухую чистую хорошо укупоренную тару и доставляют в лабораторию. Ооцисты сохраняются в кале сравнительно долго. Если предполагается длительное хранение материала, то используют консерванты (10% формалин, жидкость Барбагалло, 2,5% раствор бихромата калия). Консервант смешивают с фекалиями в соотношении 2:1 и хорошо перемешивают. Хранят в холодильнике при + 4°С. Ооцисты в 2,5% растворе бихромата калия сохраняют жизнеспособность в течение года.
В клинически манифестных случаях криптоспоридиоза в окрашенных мазках фекалий обнаруживается значительное количество ооцист. При обследовании контактных лиц и реконвалесцентов, т. е. при заведомо низкой концентрации ооцист в фекалиях, используются методы обогащения — флотация и седиментация.
III. Приготовление и окраска мазков фекалий:
На предметное стекло наносят небольшое количество фекалий и равномерно размазывают тонким слоем. При необходимости к комочку фекалий можно добавить 1—2 капли физраствора. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют в смеси Никифорова (смесь равных частей эфира и 96° этилового спирта) в течение 10—15 минут, после чего опять высушивают на воздухе и окрашивают, затем подвергают микроскопии.
I. Окрашивание карболовым фуксином по Цилю-Нильсену:
Фиксирований мазок быстро провести 3—5 раз над пламенем горелки. Окрашивать раствором карболфуксина 5—20 минут. Состав раствора: фуксин основной — 2 г, 96° этиловый спирт— 12 мл, фенол — 5 мл, дистиллированная вода — до 100мл (фуксин растворить в спирте, фенол—з воде, затем слить вместе).
Промыть мазок водопроводной водой, обесцветить 7% (5—10%) раствором серной кислоты в течение 20—60 сек. промыть в воде и подкрасить в течение 5 мин 5% раствором малахитового зеленого в 10% этиловом спирте или 0,2% водным раствором метиленового синего. Промыть в воде, тщательно высушить на воздухе и исследовать под микроскопом с иммерсией.
Результаты. Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного цвета и имеют вид округлых образований диаметром до 5 мкм. Внутри некоторых ооцист удается рассмотреть удлиненные спорозоиты. Сопутствующая микрофлора окрашивается в зеленые тона.
Примечания: В красный цвет могут окрашиваться капли жироподобных веществ и гранулы детрита. Даже при случайном сходстве по размерам эти образования легко отличить от ооцист криптоспоридий по отсутствию у них отчетливой оболочки и какого-либо структурированного содержимого внутри. В сомнительных случаях серийные мазки следует окрасить иным методом. При необходимости можно уменьшить концентрацию малахитового зеленого (подбирается опытным путем). Окрашивание по Цилю-Нильсену можно производить и без предварительной фиксации мазков.
Данный метод считается одним из наиболее информативных и надежных для выявления ооцист криптоспоридий.
Краска не выцветает много месяцев.
2. Окрашивание сафранином по Кестеру.
Мазок, высушенный на воздухе, фиксировать в смеси Никифорова, снова высушить при комнатной температуре, фиксировать над пламенем горелки. Окрашивать в растворе сафранина 5 мин. (водный насыщенный раствор сафранина — 2 части, 5,6% раствор КОН — 5 частей). После ополаскивания водой дифференцировать 10 сек. в 0,1 % растворе серной кислоты, пробыть в воде и окрашивать в 5% растворе малахитового зеленого (см. выше) 10—15 сек. Промыть в воде, тщательно высушить на воздухе и исследовать под микроскопом с иммерсией.
Результаты: Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в бледно-розовый цвет и хорошо выделяются на зеленом фоне. Другие микроорганизмы не окрашиваются сафранином.
Примечание: Этот метод считается одним из наиболее точных при выявлении ооцист криптоспоридий, позволяя наиболее отчетливо видеть внутреннее, содержимое ооцист (спорозопты). Краска нестабильна, препараты быстро выцветают и непригодны для длительного хранения.
3. Окрашивание азур-эозином по Романовскому-Гимзе.
Этот широко распространенный метод окрашивания мазков крови может быть успешно применен и при выявлении ооцист криптоспородий. В ряде случаев он весьма информативен, поскольку при адекватной предварительной подготовке мазка краситель проникает внутрь ооцисты и окрашивает спорозоиты.
Мазок, фиксированный смесью Никифорова и тщательно высушенный на воздухе, быстро превести над пламенем горелки (3—5 быстрых движений). Окрашивать 10% раствором красителя от 10 до 35—40 мин. Тщательно промыть в воде (лучше в проточной водопроводной), высушить на воздухе (можно в струе холодного воздуха под феном) и исследовать под микроскопом с иммерсионной системой.
Результаты: Ооцисты криптоспоридий имеют вид неокрашенных или слабоокрашенных округлых образований диаметром до 5 мкм. Внутри некоторых ооцист удается рассмотреть бледно-голубые удлиненные и слегка изогнутые тельца (спорозоиты) с красноватыми гранулами внутри. Спорозоиты располагаются по периферии ооцисты, оставляя ее центральную часть пустой.
Примечание. Идентификация ооцист затруднена в связи с тем, что другие микроорганизмы кишечника также окрашиваются азур-эозином, причем значительно интенсивнее ооцист. В связи с этим необходимо делать тонкие мазки, в которых наложение микрофлоры не «экранировало» бы последние от наблюдателя. Окрашенные препараты не выцветают в течение многих месяцев, пригодны для длительного хранения.
