Приложение 2 - криптоспоридиоз и вич-инфекция
4. Метод флюоресцентного окрашивания.
Толстые мазки свежих фекалий высушить на воздухе, провести через раствор аурамина с фенолом, промыть водой и быстро окрасить (5—10 мин) в растворе карболового фуксина. После промывания водой высушить на воздухе и исследовать с помощью люминесцентного микроскопа (лучше с иммерсионной системой).
Результаты: Ооцисты криптоспоридий имеют вид ярко флуоресцирующих дисков, отчетливо заметных на темно-красном фоне.
IV. Методы обогащения: флотация и седиментация.
В качестве флотационных жидкостей используют насыщенные растворы хлорида натрия или сахарозы, насыщенный раствор сульфата цинка (331 г nSО4.7H2О растворить в 1 л водопроводной воды). Для флотации используют также среду Бреза (смесь насыщенных растворов сульфата магния и тиосульфата натрия и водопроводной воды в соотношении 3:3:1), смесь Павлесека (хлорид цинка — 220 г, хлорид натрия — 210 г, водопроводная вода— 800 мл) и др.
1. Флотация с центрифугированием.
Центрифугирование ускоряет процесс флотации ооцист, а также позволяет отмывать фекалии, сводя до минимума загрязнение препарата жиром или детритом. При отмывании фекалий их разбавляют водой, а не флотационной жидкостью, и процеживают в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Исследуемый материал необходимо центрифугировать в течение 1—2 мин при 2—3 тыс. об/мин или 3—4 мин при 1500 об/мин. После первого (отмывочного) центрифугирования супернатант удалить, при этом объем оставшегося осадка не должен превышать 1 мл. Добавить в пробирку флотационную жидкость на половину ее объема и ресуспендировать в ней осадок с помощью пипеток с резиновым баллоном или стеклянной палочки. Затем долить флотационную жидкость до верхнего края пробирки и центрифугировать повторно в том же режиме- в результате ооцисты сконцентрируются в поверхностной пленке жидкости. Материал с этой пленки собрать металлической петлей или стеклянным капилляром, нанести на предметное стекло, фиксировать смесью Никифорова и окрасить соответствующим методом, после чего подвергнуть микроскопии.
Видео: Откровенно о главном: Первые признаки заражения ВИЧ
2. Методы седиментации.
Обычно применяют седиментацию эфиром, для чего 0,5—1,0 г фекалий необходимо смешать с 10—12 мл изотонического раствора хлорида натрия. Тщательно перемешанную суспензию процедить через 2 слоя марли в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Осадок дважды промыть изотоническим раствором при центрифугировании, затем тщательно ресуспендировать в 10 мл 10% раствора формалина, добавить 3 мл эфира и тщательно перемешать- предварительно закрыв пробирку пробкой. Полученную смесь центрифугировать в течение 2 мин при 1 тыс. об/мин. Эфир, поверхностный детрит и формалин слить, а из оставшегося на дне пробирки осадка сделать мазки и окрасить одним из описанных ранее методов.
При модифицированном методе эфирной седиментации 0,5 мл жидких фекалий смешать с 3 мл 10% раствора формалина и размешать до получения гомогенной суспензии. Добавить 30 мл этилового эфира и тщательно перемещать путем встряхивания, затем добавить 15 мл 10% раствора формалина, перемешать и процедить полученную смесь через марлю в центрифужную пробирку. Конец пипетки с резиновым баллоном осторожно (не касаясь стенок пробирки) опустить ниже слоев эфира и детрита, отсосать нижний столбик жидкости и перенести его в другую пробирку. Новую пробирку долить 10% раствором формалина и центрифугировать в течение 10—15 мин. при 3 тыс. об/мин (длительность центрифугирования пропорциональна вязкости раствора), из осадка приготовить мазки и окрасить их одним из обычных способов.
V. Биопробы на мышах
Для постановки биопроб необходимо скормить небольшие порции фекалий новорожденным или 2—5-дневным белым мышам. При наличии в пробах ооцист криптоспоридий в фекалиях мышей через 5—8 дней будут обнаруживаться ооцисты. При вскрытии мышей в более ранний период (оптимально на 3—7-й дни) в гистологических препаратах кишечника (предпочтительно, в препаратах подвздошной кишки) будут выявляться эндогенные стадии развития криптоспоридий, локализующиеся в зоне щеточной каемки.
При постановке биопроб на животных можно к гомогенату фекалий добавлять антибиотики (пенициллин, стрептомицин, гентамицин), которые подавляют сопутствующую микрофлору, но не влияют на инвазивность ооцист криптоспоридий.
Количество ооцист криптоспоридий подсчитывают с помощью камеры Горяева, используемой в гематологической практике. После инкубации, стимулирующей эксцистирование ооцист, можно таким же способом подсчитать и количество спорозоитов.
Для количественных определений можно также подсчитывать общее количество ооцист в окрашенном мазке, приготовленном из определенного количества фекалий (например, из 0,2 г).
Видео: Plague Inc Evolved - #2 - Смерть приходит с севера
Под редакцией профессора Фролова В. М.
Доктор медицинских наук Пересадин Н. А., профессор Федченко С. Н., ассистентом Бакланова А. В.
