Бактерии коклюша и параклюша - микробиология с техникой микробиологических исследований

Одной из распространенных детских инфекций является коклюш. Возбудитель этого заболевания обнаружен в 1906 г. Борде и Жангу в мокроте больных коклюшем и назван Bordetella pertussis (рис. 75).
Морфология и тинкториальные свойства. Короткие с закругленными концами палочки имеют в длину 0,5— 2 мк и в толщину 0,2—0,5 мк. Неподвижны, спор не образуют, грамотрицательны- некоторые штаммы образуют капсулу.
Культуральные и биохимические свойства. Наилучший рост наблюдается при температуре 35—37°- факультативный анаэроб. Первые генерации требуют присутствия крови в питательной среде. Для культивирования бактерий коклюша применяется глицериново-картофельный кровяной агар, предложенный Борде и Жангу, молочно-кровяной агар и казеиново-угольный агар (КУА).

Рис. 75. Палочки коклюша. Мазок из культуры.

1. Среда Борде-Жангу. Для приготовления глицериново - картофельного кровяного агара 100 г мелко нарезанного картофеля с 200 мл 4% водного раствора глицерина варят в автоклаве, дают отстояться и сливают жидкость с осадка. На 50 мл 1 этой жидкости прибавляют 150 мл физиологического раствора поваренной соли и 5 г промытого и размельченного агар-агара, растворяют, разливают по пробиркам и стерилизуют. Перед употреблением агар растворяют, охлаждают до 45° и к нему добавляют в равной части дефибринированную кровь кролика или человека, подогретую до 40—45°. Кровяному агару дают застыть в скошенном положении или выливают в чашки.
2. Молочно-кровяной агар. Для приготовления молочно-кровяного агара рекомендуется растопить 5% водный агар с 1% поваренной соли и смешать в равных количествах с обезжиренным подогретым молоком, после чего в течение 40 минут варить в автоклаве при 0,5 атм (за это время происходит свертывание молока). Горячую смесь профильтровать через слой марли с ватой, разлить мерно по бутылкам и вновь простерилизовать в автоклаве в течение 20 минут при 0,5 атм. Затем к остуженному до 45—50° молочному агару прилить 20% дефибринированной бараньей крови. Для подавления посторонней микрофлоры к среде добавить пенициллин в количестве 5 ЕД на чашку (20 мл среды).
3. Казеиново-угольный агар (КУА) готовится следующим образом. На 1 л дистиллированной воды берут 20 мл гидролизата казеина (полученного триптическим перевариванием), 5 г хлористого натрия, 0,002 г хлористого кальция, 0,4 г углекислого натрия, 0,002 г хлористого магния, 0,25 г фосфорно-двукалиевой соли, 1 г растворимого крахмала и 20 г агар-агара. Среду варят, как обычный агар, устанавливают pH 7,2, разливают во флаконы и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 30 минут. Перед употреблением в растопленную и остуженную среду добавляют 0,2% активированного угля и 3% дрожжевого экстракта.

Колонии коклюшной палочки мелкие, приподнятые, с перламутровым блеском с зоной гемолиза (рис. 76). При дальнейшем культивировании рост становится более грубым и пышным. Коклюшные бактерии не разлагают сахаров, не образуют индола, не восстанавливают нитритов.
Резистентность. Bordetella pertussis малоустойчива, быстро погибает при кипячении и действии дезинфицирующих веществ. К холоду палочка коклюша менее чувствительна.
Патогенность для животных и токсинообразование. Палочка коклюша патогенна для белых мышей, кроликов и морских свинок. Подопытные животные при введении им больших доз как живых, так и убитых культур погибают под влиянием эндотоксина, освобождающегося при разрушении микробных тел. Для изучения токсинов коклюшной палочки используют кроликов-альбиносов. При внутрикожном введении им культуры микроба через 18—24 часа на месте введения образуются геморрагии с последующей некротизацией участка кожи.
В последние годы удалось получить ядовитое вещество типа экзотоксина, которое, будучи введено белым мышам, вызывало накопление антитоксина.
Источником инфекции являются дети преимущественно в катаральной стадии болезни, рассеивающие бактерии в капельках слизи при кашле. Заболевание передается воздушно-капельным путем. Входными воротами инфекции является слизистая оболочка верхних дыхательных путей. Микробы локализуются на слизистой оболочке дыхательных путей и в легких, но в болезненный процесс вследствие действия токсинов вовлекается весь организм.
Инкубационный период равен 3—11 дням.
Течение заболевания можно разделить на три периода: 1) катаральный период, характеризующийся незначительным повышением температуры, головной болью, кашлем и насморком- длительность этого периода от 5 до 11 дней- 2) конвульсивный период — в этом периоде больной ребенок страдает от мучительных приступов кашля. Во время приступа лицо его становится одутловатым, цианотичным, глаза выпячиваются- число конвульсивных приступов кашля в тяжелых случаях может достигать 30 в сутки- 3) период разрешения— отличается от предыдущего периода тем, что приступы кашля становятся все более редкими, легче переносятся больным и, наконец, совсем прекращаются.
В основе патогенеза коклюша лежит действие эндотоксинов коклюшных палочек на нервные волокна блуждающего нерва, по которому возбуждение передается в дыхательный центр. Различные осложнения, которые могут иметь место при коклюше, некоторые исследователи объясняют как результат развития инфекционной аллергии.
Очень сходную с коклюшем клиническую картину заболевания вызывает паракоклюшная палочка (Bordetella parapertussis). Дети, перенесшие коклюш, могут заболеть паракоклюшем.
По морфологическим, тинкториальным, культуральным и антигенным свойствам паракоклюшная палочка сходна с коклюшной. Отличается она только характером роста на некоторых питательных средах и способностью ферментировать мочевину (табл. 11).
Таблица 11
Основные дифференциальные признаки бактерий коклюша и паракоклюша

Иммунитет. Перенесенное заболевание оставляет прочный антимикробный иммунитет. В сыворотке больных и реконвалесцентов обнаруживаются агглютинины и комплементсвязывающие антитела.
Микробиологическая диагностика. Материалом для лабораторного исследования служит мокрота, чаще — слизь из носоглотки и гортани, получаемая методом «кашлевых пластинок». Выделение культуры несколько затрудняется тем, что в зеве больных детей имеется немало сапрофитных микробов, препятствующих выращиванию палочек коклюша. Поэтому более выгодно брать исследуемый материал из глубины носоглотки специальным тампоном (глубокий ватный тампон). К тому же у больного в момент взятия материала может долго отсутствовать кашель.

Брать материал надо не касаясь, наружного края пробирки, а также слизистой языка, щек и кожных покровов, чтобы посторонняя микрофлора не попала на тампон.

Рис. 76. Колонии коклюшной палочки на среде КУА.
Метод забора материала при помощи тампонов значительно повышает процент высеваемости коклюшной палочки.
Взятый от больного материал методом «кашлевых пластинок» или тампоном засевают на специальные питательные среды: глицериново-картофельный агар по Борде, молочно-кровяной агар или казеиново-угольный агар (КУА).
Для подавления роста посторонней микрофлоры, препятствующей размножению палочки коклюша или паракоклюша, к агару добавляют за 0,5 часа до засева пенициллин (15—25 ЕД на 12 мл среды) и равномерно распределяют по поверхности среды. Чтобы обеспечить достаточную влажность, необходимую для размножения коклюшных и паракоклюшных палочек, в термостат ставят открытый сосуд с водой. На среде Борде—Жангу на 2—5-е сутки бактерии коклюша и паракоклюша образуют типичные мелкие, выпуклые, четко очерченные, блестящие, напоминающие капельки ртути, колонии (рис. 76). На молочном, кровяном и казеиново-угольном агаре колонии более крупные, беловатого цвета с перламутровым блеском.
Из колоний с признаками, характерными для бактерий коклюша или паракоклюша готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в препаратах мелких, овоидной формы грамотрицательных палочек ставят микроскопическую агглютинацию с противококлюшной сывороткой.
Агглютинирующую сыворотку разводят физиологическим раствором 1:100 и на предметное стекло наносят одну каплю разведенной сыворотки и одну каплю физиологического раствора для контроля. Петлей снимают одну колонию с агара и эмульгируют ее в небольшом количестве физиологического раствора. Две—три капли этой взвеси отдельными пипетками смешивают с агглютинирующей сывороткой и физиологическим раствором. При положительном результате реакция агглютинации проявляется немедленно, в редких случаях в течение 5— 10 минут. В капле физиологического раствора реакция агглютинации отсутствует и жидкость сохраняет равномерную муть. Паракоклюшная палочка тоже агглютинируется коклюшной сывороткой в небольшом разведении, так как бактерии коклюша и паракоклюша обладают общими антигенами.
Для дифференциации коклюшной и паракоклюшной бактерий из колоний на чашках делают пересев на скошенный агар с той же питательной средой, которая использовалась для выделения возбудителя из патологического материала. Посев ставят в термостат при 37° на сутки. Чистая культура паракоклюшной палочки вырастает уже через 24 часа, а коклюшной только через 48 часов. Происходит также изменение цвета питательной среды при росте паракоклюшной палочки. Казеиново-угольный агар окрашивается диффузно в буроватокоричневый цвет, а агар Борде и молочно-кровяной агар заметно темнеют. При росте коклюшной палочки цвет питательной среды не изменяется. Коклюшная палочка на обычном агаре не растет, рост паракоклюшной палочки сопровождается диффузным окрашиванием среды в коричневый цвет. Для окончательной идентификации паракоклюшной палочки ставят пробу на уреазу. Пробирку встряхивают и ставят в термостат на 30 минут. Паракоклюшные бактерии, продуцирующие уреазу, расщепляют мочевину с образованием аммиака, который изменяет цвет среды на малиново-красный цвет.
Серологическая диагностика коклюша основана на постановке реакции агглютинации и реакции связывания комплемента. Так как при коклюше развивается аллергическое состояние, то с целью диагностики можно поставить аллергическую пробу, которую учитывают через 24 часа после введения внутрикожно 0,1 мл коклюшного антигена.
Специфическая профилактика. Активная иммунизация при помощи вакцин показала ее несомненную эффективность.
В настоящее время в практику введены смешанная коклюшно-дифтерийная вакцина и коклюшно-дифтерийно-столбнячная. Эти препараты представляют собой смесь, состоящую из коклюшных микробов, убитых мертиолятом, и очищенного концентрированного дифтерийного и во второй вакцине столбнячного анатоксина (АКДС).
С целью профилактики детям, контактировавшим с больным, можно вводить 1,5—3 мл человеческого гамма-глобулина.
Для лечения рекомендуют антибиотики — стрептомицин, тетрациклин, окситетрациклин и др.