Вирусы - микробиология с техникой микробиологических исследований

К группе вирусов, как было указано в разделе «Общая микробиология», относятся микроорганизмы, которые так малы, что проходят через фильтры, задерживающие обычных микробов.
Более половины инфекционных болезней человека вызываются вирусами. Столь же широко распространены вирусные болезни среди животпых и растений. Немало также накопилось данных, свидетельствующих о несомненной роли вирусов в возникновении доброкачественных и злокачественных новообразований (опухолей).
Все это делает проблему вирусных заболеваний весьма актуальной в современной вирусологии, над которой работают многие ученые разных специальностей: медики, биологи, зоологи, ботаники и др.

ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ ВИРУСОВ

История открытия вирусов насчитывает уже более полувека, и начало ее положено в нашей стране.
В 1892 г. русский ученый-ботаник Д. И. Ивановский обнаружил, что инфекционное начало «мозаичной болезни» табака, содержащееся в тканевом соке больных растений, свободно проходит через фильтры, задерживающие бактерий, в силу чего фильтрат не утрачивает своей заразительности и вызывает заболевание у здоровых растений. Работы Д. И. Ивановского положили начало развитию новой, области биологии и медицины — вирусологии, теоретическое и практическое значение которой чрезвычайно велико.
Особенно широкие исследования вирусов начались после гриппозной пандемии 1919—1920 гг., привлекшей усиленное внимание ученых к вирусным инфекциям.
Большая роль в развитии вирусологии принадлежит советским ученым (Н. Ф. Гамалея, Л. А. Зильбер, М. А. Морозов, Е. Н. Павловский, А. А. Смородинцев, В. М. Жданов и др.).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ

Вирусами называются возбудители инфекционных поражений человека, животных, растений, бактерий и актиномицетов, характеризующиеся следующими особенностями:

1. малыми размерами тела, определяемыми десятками или сотнями миллимикронов (1 ммк равняется 0,001 мк)- прямым следствием этого является фильтруемость вирусов, т. е. проходимость их через бактериальные фильтры;
2. отсутствием клеточного строения;
3. относительной простотой химического состава, нередко включающего только гидратированный белок и специфическую нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК);
4. своеобразием обмена веществ, зависящим от обмена веществ клетки, внутри которой паразитируют;
5. неспособностью размножаться на -искусственных питательных средах;
6. особым способом размножения;
7. накоплением и прохождением определенного цикла развития в организме восприимчивого хозяина;
8. малой эффективностью действия на них многих антибиотических и химиотерапевтических веществ.

Форма и величина вирусов. Вирусы имеют разнообразную форму: шаровидную, кубовидную, сперматозоидную, коротких или длинных палочек, иногда изогнутых.
Изучение морфологии вирусов стало возможным благодаря применению специальных методов окраски и изобретению электронного микроскопа.
М. А. Морозов предложил метод окраски вирусов путем обработки их танином и солями серебра. При этом соли серебра наслаиваются на разбухшую после воздействия танина частицу вируса, в результате чего ее размеры увеличиваются, и вирус становится видным в обычный микроскоп.
Размеры большинства вирусов колеблются в пределах от 30 до 100 ммк. Наиболее мелкие вирусы имеют величину 10—15 ммк. К ним относятся возбудители ящура и полиомиелита. Размеры этих вирусов приближаются к размеру крупных белковых молекул, например оксигемоглобина. Некоторые вирусы могут кристаллизоваться в естественных условиях внутриклеточной жизни и в пробирке. Наиболее крупные вирусы человека и животных, которые при специальных методах окраски становятся видимыми в микроскоп, составляют группу так называемых элементарных телец (например, возбудители оспы и ряда других заболеваний).
Для измерения вирусных частиц широко применяются не только методы микроскопии, но и методы
фильтрации и центрифугирования. Вирусы, как указано выше, проходят через бактериальные фильтры. Однако можно подобрать такие фильтры, размеры пор которых оказываются достаточно малыми, чтобы задержать вирусы. Используя фильтры с порами разного размера, можно приближенно установить размеры вирусных частиц. Такие фильтры изготовляют из коллодия, растворяемого в смеси спирта, эфира и ацетона (градоколовые мембраны).
Размеры вирионов определяются также при фотографировании вируса в ультрафиолетовых лучах и при помощи электронного микроскопа.
Химический состав. В состав вирусов входят белки — нуклеопротеиды, нуклеиновая кислота (ДНК или РНК), углеводы, липоиды и металлы. У бактериальных вирусов (бактериофагов) нуклеиновой кислоты содержится до 50%, у других вирусов ее не более 10%. Количество липидов тоже различно. Так, вирус вакцины содержит их 5,8%, вирус гриппа 25—44%, арбовирусы 11—50%. Ферменты выявлены у бактериофагов, вируса гриппа, оспы и др.
Культивирование вирусов. Невозможность выращивания на искусственных питательных средах является общим свойством вирусов. Вот почему лабораторное исследование вирусных заболеваний возможно только в специально оборудованных лабораториях. Существуют следующие способы культивирования вирусов.

1. Культивирование вирусов в развивающемся курином зародыше. Техника этого метода заключается в следующем. Куриное яйцо подвергают инкубации при 38° в течение 6—13 дней. Когда наступает развитие зародыша, под скорлупу яйца путем прокола асептически вводят в хорионаллантоисную полость, на хорионаллантоисную оболочку, желточный мешок либо в аллантоисную полость (рис. 112 и 113) материал, содержащий вирус. Место прокола заливают парафином и яйцо помещают в термостат при 37° на 3—4 дня. В результате вирус размножается, вызывая те или иные видимые изменения. Например, при росте вируса коровьей оспы на хорионаллантоисной оболочке образуются белые мутные пятна.
2. Культивирование вирусов в культуре ткани. Для выделения многих вирусов в настоящее время широко используют метод культуры ткани.

Рис. 112. Заражение в желточный мешок.
1 — хориоиаллантоисная оболочка- 2 — желточный мешок- 3 — белок- 4 — хорионаллантоисная полость- 5 — воздушная камера.
Рис. 113. Заражение в аллантоисную полость.
1 — воздушная камера- 2 — желточный мешок- 3 — белок- 4 и 6 — хорионаллантоисная полость- 5 — зародыш.
Особенно распространены однослойные культуры, которые получают из эмбриона человека, курицы, ткани почек и сердца обезьян циномольгус (СОЦ), воздействуя на ткани раствором теплого трипсина. Этот раствор разъединяет клетки ткани, сохраняя у них способность к размножению. Клеткам для роста вне организма требуются самые различные питательные вещества. Поэтому клеточную взвесь, тщательно отмытую фосфатно-буферным раствором, смешивают с питательной средой. Различают: 1) естественные питательные среды, состоящие из сыворотки животных, эмбрионального экстракта и солевого раствора Хенкса и 2) синтетические питательные жидкости, например, среда Паркера, которая содержит 19 аминокислот, ряд витаминов, пурины и пентозы.
Полученную трипсинизированную клеточную взвесь с питательной средой наливают в пробирки с уплощенной стороной, чашки Гейденрейха—Петри, плоскодонные колбочки, матрацы и ставят в термостат. Слой клеток появляется через 3—7 дней.
Культуры тканей получают также из перевиваемых в лабораторных условиях штаммов клеток злокачественных опухолей (штамм HeLa — клетки рака шейки матки женщины, по имени Helen L. и штамм Нер-2, выделенный от больного раком гортани). Эти клетки через 4—5 дней дают сплошной рост по стенке пробирок или по дну чашек или колб.
Однослойную культуру промывают фосфатно-буферным раствором и на нее наносят стерильно материал, содержащий вирус. Возможность бактериального загрязнения (что приводит к прекращению роста и гибели клеток) исключается добавлением в культуру клеток антибиотиков, не влияющих на рост вирусов. Пробирки, колбы с посевами закрывают резиновыми пробками, что обеспечивает сохранение углекислого газа, поддерживающего нейтральную реакцию среды. Резиновые пробки не должны касаться питательной жидкости. Посевы ставят в термостат (пробирки почти в горизонтальном положении) при 37°. Размножение вируса в культуре ткани происходит в различные сроки (в зависимости от свойств вируса и его количества в исследуемом материале, а также от вида культуры ткани).
О   наличии вируса в засеянном материале судят по так называемому цитопатогенному действию. Пласты зараженных клеток отваливаются от стенок пробирки или колбы. Под микроскопом ясно видны дегенеративные изменения в клетках. В питательные среды добавляют индикатор, который позволяет невооруженным глазом обнаружить размножение вируса. Если цвет индикатора не изменился, то это будет свидетельствовать о прекращении обмена в отмирающих клетках, и тогда pH среды не изменится. В культурах тканей, не зараженных вируса ми, под влиянием продуктов обмена веществ клеток pH среды изменяется в кислую сторону, показателем чего является пожелтение фенолрота, добавленного в среду. Вирусы могут вызывать образование включений, как внутри цитоплазмы, так и внутриядерные.
Культивирование вирусов можно проводить в присутствии переживающих тканей. В стерильную пробирку помещают свежеполученную почку кролика или курицы и сюда же асептично вносят жидкость, содержащую вирус (без примеси бактерий). Затем добавляют стерильную жидкость Тироде и сыворотку кролика. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, разливают по чашкам Карреля и выращивают в термостате при 37° в течение 4—7 дней.
Устойчивость вирусов. При температуре выше 100° инактивируются все вирусы. При менее высокой температуре они проявляют различную жизнеспособность. К низким температурам вирусы нечувствительны. Вирусные суспензии при температуре —70° могут сохраняться годами. Концентрированные солнечные лучи, так же как ультрафиолетовое облучение, оказывают инактивирующее действие на вирусы. Рассеянный солнечный свет действует менее активно. Кислоты, щелочи, фенол, формалин, марганцовокислый калий и др. инактивируют вирусы. Однако в 0,5% растворе фенола вирус бешенства сохраняет жизнеспособность до 3 месяцев.
Некоторые вирусы, инактивированные формалином, остаются иммуногенными, что позволило использовать формалин для получения вакцин. Хорошими дезинфицирующими средствами являются 3—5% раствор лизола, мыло и мыльные растворы. Длительно сохраняются в высушенном состоянии вирусы бешенства, оспы, герпеса, гриппа, кори и др. Многие вирусы устойчивы к глицерину.
Восприимчивость к вирусам. Для некоторых вирусов круг восприимчивых животных очень широк, например для вируса бешенства, оспы и т. д. Для других он значительно уже. Часто данный вирус поражает только какой-нибудь вид животных (например, вирус чумы свиней патогенен только для свиней).
Пути распространения и выделения вирусов. Основной путь распространения вирусов в организме — гематогенный (через кровь), и кровь в тот или иной промежуток времени может содержать большое количество вируса. Для некоторых нейротропных вирусов принимается и другой путь распространения — по нервам.
Некоторые вирусы выделяются через носоглотку или с мочой и калом. Слюна животного, больного бешенством, крайне заразительна. Вирус гриппа легко удается обнаружить в дыхательных путях. Вирус полиомиелита можно найти в смывах из носоглотки и в испражнениях больных.
Антигенные свойства и иммунитет. Вирусы, как и другие микроорганизмы, обладают антигенными и иммунногенными свойствами.
При вирусных болезнях, как и при бактериальных, заболевание оставляет после себя иммунитет различной напряженности и длительности в зависимости от характера инфекции. Так, при бешенстве, оспе, чуме свиней создается стойкий и продолжительный иммунитет, иногда до конца жизни, грипп оставляет кратковременный иммунитет. Большинство же вирусных заболеваний оставляет после себя продолжительный иммунитет.
Антитела, агглютинирующие, преципитирующие, комллементсвязывающие и нейтрализующие вирус, описаны при ряде вирусных инфекций.
При вирусных болезнях, как и при бактериальных, можно вызвать искусственный иммунитет профилактическими прививками как живого, так и убитого вируса.
В настоящее время установлено, что противовирусный иммунитет имеет ряд своеобразных особенностей. Например, естественная невосприимчивость к вирусам, а также иммунитет после перенесения некоторых вирусных заболеваний не связаны ни с антителами, ни с фагоцитозом.
Велика защитная роль при вирусных заболеваниях таких естественных факторов иммунитета, как интерферон (вещество белковой природы, выделяемое клеткой при взаимодействии с маловирулентным вирусом), ингибиторы — содержащиеся в слюне и крови человека. Таким образом, механизм противовирусного иммунитета нуждается в дальнейшем изучении.
Эпидемиология. В настоящее время насчитывается свыше 35 инфекций человека с установленной вирусной этиологией. Возникновение вирусных заболеваний, их распространение и угасание подчинены тем же закономерностям, которые известны для инфекций бактериальной или протозойной природы.
Некоторое своеобразие в эпидемиологии вирусных болезней человека можно видеть в сравнительно малом значении кишечника как места локализации инфекции и в тех особенностях, которые обусловлены общим свойством всех вирусов — их внутриклеточным паразитизмом. Последнее определяет большое распространение скрытых, латентных форм инфекции или вирусоносительства. Факт длительного вирусоносительства доказан при многих вирусных болезнях (например, при герпесе, полиомиелите, инфекционной анемии лошадей).
Вирусные болезни могут передаваться:
а)    капельно-аэрогенным путем (грипп, оспа, корь)-
б)    контактным путем (венерическая лимфогранулема, бородавки)-
в)    трансмиссивным путем (энцефалиты, москитная лихорадка)-
г)    алиментарным путем (полиомиелит, гепатит).
Лабораторная диагностика. Для диагностики вирусных заболеваний применяют.

1. Микроскопическое (вирусоскопическое) исследование. Крупные вирусы в виде элементарных телец определяются под обычным микроскопом, мелкие — в электронном. Широко применяется исследование гистологических срезов пораженных тканей для выявления характерных включений внутри клеток, например, тельца Негри при бешенстве.
2. Посев исследуемого материала в культуру ткани или в развивающийся куриный эмбрион.
3. Серологическое исследование. Постановка реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента и реакции нейтрализации вируса,
4. Биологический метод. Заражение исследуемым материалом восприимчивых животных. Этот метод применяется для накопления вируса и для выявления тех специфических изменений, которые происходят в организме экспериментального животного.

Профилактика и лечение. Лечение вирусных заболеваний — наиболее трудная и малоразработанная область вирусологии.
Профилактика вирусных инфекций сводится к следующему:

1. общие санитарно-гигиенические мероприятия;
2. борьба с переносчиками вирусных инфекций;
3. специфические мероприятия (вакцинация и серопрофилактика).

Вакцинация применяется с целью предупреждения заболеваний, склонных к эпидемическому распространению (например, при оспе).
Противовирусные вакцины представляют собой чаще всего либо взвесь тканей или органов инфицированного животного, либо суспензию тканей куриного зародыша, зараженного инактивированным фенолом или формалином вирусом. Формалиновые вакцины нашли практическое применение для предупреждения весенне-летнего, японского, лошадиного энцефалита и гриппа. Наилучшими являются живые вакцины, в которых вирус не инактивирован, но настолько видоизменил свои первоначальные свойства (вирулентность), что потерял инфекциозность, сохранив иммуногенность. В настоящее время применяются следующие живые вакцины: противооспенная, вакцина против желтой лихорадки, бешенства, полиомиелита, гриппа, кори.
Для профилактических целей иногда пользуются специфической сывороткой (например, при кори). Вакцинотерапия и химиотерапия вирусных заболеваний в силу малой эффективности не находят широкого применения.
Классификация вирусов. Имеется несколько классификаций вирусов. По месту обитания в организме хозяина вирусы делятся на четыре группы: вирусы бактерий, растений, насекомых и вирусы животных.
По сродству (тропизму) к определенным тканям в человеческом организме различают следующие вирусы.

1. Нейротропные, поражающие центральную нервную систему (вирус бешенства, вирусы энцефалитов).
2. Дермотропные, вызывающие поражение кожи и слизистых оболочек (вирус оспы, вирус ящура и др.).
3. Пневмотропные, вызывающие поражение органов дыхания (вирус гриппа, аденовирусы и др.).
4. Пантропные — вирусы, тропизм которых не всегда ясно выражен (вирус эпидемического паротита, вирус желтой лихорадки и др.).

Но такое деление считается условным, так как тропизм вирусов может изменяться под влиянием среды обитания.
Основные группы вирусов человека.
РНК-coдержащие вирусы

1. Ортомиксовирусы:

Вирус гриппа

1. Парамиксовирусы:

а)  парагриппозные вирусы,
б)  вирус паротита,
в)   вирус кори (возможно)

1. Рабдовирусы: вирус бешенства
2. Энтеровирусы:

а)   вирус полиомиелита,
б)   вирусы Коксаки и ECHO,
в)   вирус ящура

1. Арбовиры:

а)   вирус весенне-летнего клещевого энцефалита,
б)   вирус лихорадки паппатачи
ДНК-coдержащие вирусы

1. Аденовирусы
2. Поксвирусы:

а) вирус натуральной оспы

1. Герпесвирусы:

а)   вирус ветряной оспы,
б)   вирус опоясывающего герпеса

1. Паповавирусы

ОРТОМИКСОВИРУСЫ

Вирусы, входящие в эту группу, отличаются тропизмом к мукопротеидным субстанциям, отсюда и название всей группы.
Миксовирусы культивируются в культурах ткани или курином эмбрионе и вызывают у человека преимущественно заболевания верхних дыхательных путей.