Холерный вибрион - микробиология с техникой микробиологических исследований
Холерный вибрион (Vibrio cholerae asiaticae), открытый Р. Кохом в 1883 г., является возбудителем острого тяжелого инфекционного заболевания — холеры, которая характеризуется поражением желудочно-кишечного тракта с явлениями общей интоксикации и локализацией возбудителя в тонком кишечнике.
Рис. 81. Холерный вибрион.
1 — в чистой культуре- 2 — мазок из испражнений- 3 — разжижение желатины.
Морфология и тинкториальные свойства. Холерному вибриону свойствен выраженный полиморфизм. В окрашенных препаратах он имеет форму изогнутой палочки длиной от 1,5 до 3 мк и шириной от 0,2 до 0,4 мк. Степень изогнутости весьма различна: наряду со слабо изогнутыми формами в виде запятой встречаются формы полукруга. На искусственных питательных средах и в организме больных людей вибрионы могут принимать форму прямых палочек, нитей, длинных спиралей, кокков. Спор и капсул не образует, очень подвижен—монотрих (рис. 81), легко окрашивается всеми анилиновыми красками, грамотрицателен.
Культуральные и биохимические свойства. Холерный вибрион неприхотлив к питательным средам, хорошо и быстро размножается на плотных и жидких средах щелочной реакции (pH 7,6—82), строгий аэроб, оптимум роста 37°. На мясо-пептонном щелочном агаре через
10—12 часов инкубации в термостате образуются круглые, мелкие (1—2 мм в диаметре) колонии с гладкой поверхностью, стекловиднопрозрачные в проходящем свете. Консистенция колоний маслянистая, при малом увеличении микроскопа они гомогенны, светло-желтого цвета. В более поздние сроки (после 18 часов стояния в термостате) они мутнеют. На бактоагаре TCBS (см. стр. 287) колонии холерного вибриона крупные, желтые, плотные на фоне голубовато-зеленого цвета среды. При стоянии из желтых становятся зелеными. На среде Аронсона колонии ярко-красного цвета с бледно-розовой или бесцветной каймой, а на среде Монсура через 24 часа роста образуются прозрачные или полупрозрачные колонии серовато-черного цвета с помутнением по краям. В более поздние сроки (через 48 часов) колонии увеличиваются в размере (до 3—4 мм), становятся слизистыми, с черным центром и хорошо очерченным краем. На щелочной пептонной воде уже через 6—8 часов роста появляется тонкая, нежная пленка, хорошо заметная на стенке пробирки при небольшом ее наклоне. Накопление холерных вибрионов идет быстро, поэтому пептонная вода как элективная среда широко используется в ранней диагностике холеры. Холерный вибрион может диссоциировать, переходя из S-формы в R-форму. R-формы холерного вибриона на пептонной воде образуют грубую, иногда сухую морщинистую пленку. Холерный вибрион весьма активен в биохимическом отношении. Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, левулезу, галактозу, сахарозу, мальтозу, маннозу и крахмал, оставляя без изменения лактозу, арабинозу, дульцит. На желатине при посеве уколом рост представляется в виде белой линии, затем наступает ее разжижение с поверхности в виде пузырька (см. рис. 81). Образует индол, аммиак и сероводород, восстанавливает нитраты в нитриты.
Холероподобные вибрионы. В окружающей нас природе (вода, земля), у людей (во рту и кишечнике) и животных встречаются вибрионы, морфологически и биологически сходные с холерным вибрионом. Эти холероподобные вибрионы не обладают патогенностью, но они могут затруднить бактериологическую диагностику холеры. Большинство холероподобных вибрионов в отличие от холерных гемолизирует бараньи эритроциты и не разлагает крахмала. Дифференцирующим признаком является также способность холерного вибриона ферментировать маннозу, сахарозу, оставляя без изменений арабинозу. Для точной дифференциаций холерных вибрионов от холероподобных надо использовать реакцию агглютинации со специфической сывороткой и поставить опыт с холерным бактериофагом (на лизируемость выделенной культуры).
Антигенная структура и серологические типы. Холерный вибрион обладает двумя антигенами: соматическим термостабильным О-антигеном и жгутиковым термолабильным Н-антигеном. Холерные вибрионы отличаются от холероподобных вибрионов только О-антигеном. Поэтому для дифференциации нужно пользоваться агглютинирующими О-сыворотками, которые агглютинируют только холерные вибрионы. Японские авторы подразделяют холерный вибрион на три серотипа: I (тип Инаба), II (тип Огава) и III (тип Гикошима). В 1962 г. по рекомендации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) к холерным вибрионам отнесен и вибрион Эль-Тор. Свое название этот вибрион получил от карантинной станции Эль-Тор в Африке, где он впервые был выделен в 1905 г. от больного с клинической формой холеры и описанный в 1906 г. Р. Готшлихом.
Вибрион Эль-Тор отличается от классического холерного вибриона тем, что гемолизирует эритроциты барана и козы в жидкой среде (проба Грейга), вызывает гемагглютинацию эритроцитов курицы, устойчив к антибиотику полимиксину. Однако встречается такая разновидность вибриона Эль-Тор, которая подобно классическому вибриону не гемолизирует эритроцитов барана. Сходство и различие между холерными вибрионами представлены в табл. 19.
Резистентность. Устойчивость холерных вибрионов невелика: нагревание при 56° они выдерживают не более получаса. К действию дезинфицирующих растворов весьма чувствительны: 3% раствор карболовой кислоты убивает их через 3—5 минут, раствор сулемы 1 : 1000 — через 10 минут. Особенно чувствительны холерные вибрионы к действию кислот: соляная и серная кислоты даже в разведении 1 : 100 000 убивают их в течение нескольких секунд.
Таблица 19
Дифференциально-диагностические признаки холерных вибрионов
Характеристика | ||
Признак Видео: УППВ-2 | классического холерного вибриона | вибриона Эль-Тор |
Морфология микробной клетки | Вибрион подвижный (1 жгутик) | Вибрион подвижный (1 жгутик) |
Тинкториальные свойства | Г рамотрицательный | Г рамотрицательный |
Культуральные свойства | Растет на щелочной среде, колонии гладкиепрозрачные | Растет на щелочной среде, колонии гладкиепрозрачные |
Биохимическая активность | Ферментирует сахарозу, маннозу с образованиемкислоты без газа, не разлагает арабинозу | Ферментирует сахарозу, маннозу с образованиемкислоты без газа, не разлагает арабинозу |
Агглютинабельность холерной О-сывороткой | Агглютинируется не менее чем до 1/2 титра | Агглютинируется не менее чем до 12 титра |
типа Огава | + или — | + или — |
» Инаба | — или + | — или + |
Чувствительность к диагностическим бактериофагамС | Лизируется | Не лизируется |
Эль-Тор II | Не лизируется | Лизируется |
Чувствительность к полимиксину (50 ЕД в 1 млсреды) | Чувствителен (нет роста) | Не чувствителен (есть рост) |
Реакция гемагглютинации куриных эритроцитов | Не агглютинирует | Агглютинирует |
Гемолиз бараньих эритроцитов | — | — или + |
Реакция Фогеса—Проскауэра | — | -f или — |
Протеолитическая активность | + | + |
Диастатическая активность | + | + |
Гексаминовы й тест | + Видео: Вода на побережьях Махачкалы признана самой грязной среди прибрежных вод республики | |
Патогенность для животных и токсинообразование.
В естественных условиях холерой болеют только люди. Животные обладают видовой невосприимчивостью к холере. И. И. Мечникову удалось заразить кроликов-сосунков, смазывая соски кормящей самки культурой холерного вибриона. У животных появлялись симптомы поражения тонкого кишечника, напоминающие холерный энтерит у человека. Д. К. Заболотный экспериментально вызвал холероподобное заболевание у сусликов, вскармливая их культурой холерного вибриона.
В патогенезе заболевания большая роль принадлежит эндотоксину и продуктам жизнедеятельности вибриона. Эндотоксин состоит из двух компонентов:
а) термолабильного глюцидолипоидного, вызывающего гиперемию кишечника и б) термостабильного фосфолипидного, обусловливающего гипотермию (понижение температуры тела). В фильтратах кишечного содержимого и испражнениях находятся токсические факторы, среди которых наибольшее значение имеют два: 1) ингибирующий реабсорбцию натрия из кишечного канала в кровь- 2) кадаверин — повышающий проницаемость капилляров кишечника для токсических веществ холерного вибриона.
Патогенез и клиника холеры. Источниками инфекции при холере могут быть: а) заразившиеся холерой люди, которые выделяют холерных вибрионов с испражнениями уже в конце инкубационного периода и в периоде продромальных явлений- б) больные с различными формами холеры- в) реконвалесценты- г) здоровые вибриононосители. Заражение холерой происходит через рот при употреблении инфицированных пищевых продуктов, воды или в результате контакта с больным человеком, который с испражнениями и рвотными массами выделяет большое количество холерных вибрионов. В этом случае холерный вибрион заносится в рот загрязненными руками при уходе за больным и при соприкосновении с различными предметами, содержащими выделения больных (предметы домашнего обихода, загрязненное белье и т. д.). Кислое содержимое желудка служит препятствием для дальнейшего продвижения холерных вибрионов по пищеварительному тракту. Однако в случаях пониженной кислотности желудочного сока, ахилии, при обильном питье или наличии вибрионов внутри пищевых комков они могут пройти через губительный для них кислый барьер желудка и попасть в двенадцатиперстную кишку, а затем в тонкий кишечник. В кишечнике холерные вибрионы находят щелочную среду и обилие продуктов
распада белка, что дает им возможность быстро размножаться.
Одновременно происходит распад микробных клеток с освобождением эндотоксина, который некротизирует эпителий кишечника. Через лимфатические и кровеносные сосуды поврежденной слизистой оболочки кишечника эндотоксин и продукты жизнедеятельности холерных вибрионов поступают в кровь и обусловливают весь симптомокомплекс заболевания холерой — понос, рвоту, нарушение водно-солевого обмена, тяжелые явления со стороны сердечно-сосудистой и нервной системы, общую интоксикацию. Инкубационный период при холере короткий— от 1—2 до 5 дней. Заболевание обычно наступает внезапно. По клиническому течению заболевания различают следующие формы холеры:
- холерный энтерит (холерный понос или диарея). Это легкая форма холеры. Жидкий стул и рвота при этой форме заболевания могут быть однократными, а обезвоженность почти не наблюдается. Самочувствие больного удовлетворительное. Длительность болезни обычно ограничивается 1—2 днями;
- холерный гастроэнтерит. Это форма холеры со средней тяжестью течения. Начинается гастроэнтерит чаще всего внезапно с появления профузного поноса, который становится все более частым до 15—20 раз в сутки. Стул больного, с плавающими в нем обрывками некротизированного эпителия, напоминает рисовый отвар. Затем к поносу присоединяется рвота. В результате организм больного резко обезвоживается, появляются судороги отдельных групп мышц, голос становится охрипшим, температура тела понижается. Самочувствие больных плохое. Они жалуются на недомогание, резкую слабость, сухость во рту и жажду;
- холерный алгид. Это самая тяжелая форма холеры. Клинические явления те же, что и при гастроэнтерите, но более резко выражены. Потеря жидкости может достигать 8—10% от веса больного. Кожа обезвоживается, холодная на ощупь, теряет тургор и собирается в складки. Сердечная деятельность резко ослабляется вследствие повышения вязкости крови, появляется сильная одышка, цианоз (синюшность), анурия (отсутствие мочи), температура тела снижается до 35—34°. Смертность при этой форме заболевания наиболее высокая.
Встречаются тяжелейшие скоротечные алгидные формы холеры, которые при отсутствии поноса и рвоты в результате резкой интоксикации заканчиваются летальным исходом (сухая холера).
Патогенез, клиника и микробиологическая диагностика холеры изложены в соответствии с инструкцией и методическими указаниями по клинической и лабораторной диагностике, лечению и профилактике холеры.
Иммунитет. Перенесенная холера оставляет достаточно стойкий иммунитет- повторные заболевания наблюдаются редко. В организме переболевших обнаруживают бактериолизины, агглютинины, преципитины и бактериотропины.
Микробиологическая диагностика. Материалом для лабораторного исследования на холеру служат испражнения и рвотные массы, предметы, загрязненные выделениями больных, трупный материал, вода, пищевые продукты и т. д. Холера относится к группе особо опасных инфекций, поэтому забор материала, его транспортировка в лабораторию и само бактериологическое исследование требуют особых мер предосторожности. Нативный материал (испражнения и рвотные массы) собирают в индивидуальное судно, тщательно промытое кипяченой водой от возможных остатков дезинфицирующего раствора. На дно судна кладут меньший по размерам сосуд или стерильные листы пергаментной бумаги, целлофана и др. При помощи стерильных металлических, картонных или деревянных ложек выделения в объеме 10—20 мл переносят в стерильную широкогорлую баночку, плотно закрывают стеклянной или корковой пробкой, под которую заложена пергаментная бумага. Пробку на баночке обвязывают двойным слоем пергаментной или вощаной бумаги. При отсутствии широкогорлых баночек образцы выделений можно помещать в стерильные пробирки. В этом случае для переноса материала используют стерильные стеклянные трубочки диаметром 0,6—0,8 см и длиной 6—8 см. Трубочку захватывают корнцангом, зачерпывают ею выделения и помещают в пробирку, которую закрывают непромокаемой пробкой.
Рис. 82. Специальная петля для забора материала на возбудителя холеры.
Для взятия материала у больных с выраженным гастроэнтеритом можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую кишку, другой опускают в банку или пробирку. Жидкие испражнения набираются в сосуд свободно или при легком надавливании на брюшную стенку. Взять материал для исследования можно также ректальными стеклянными трубками, ректальными ватными тампонами и специальной петлей. Петли готовят из алюминиевой проволоки диаметром 2—3 мм, длиной 40—50 см, складывая ее вдвойне (рис. 82). Стерильную петлю смачивают стерильным физиологическим раствором и вводят в прямую кишку на 8—10 см. Взятый материал засевают на питательную среду или помещают в консервирующую жидкость. После употребления петли обеззараживают кипячением.
При постановке посмертного диагноза берут отрезки из верхней, средней и нижней части тонкого кишечника длиной около 10 см. Отрезки вырезают между двумя лигатурами, наложенными на оба конца взятого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Взятые образцы органов трупа укладывают отдельно в стерильные банки с притертыми стеклянными или корковыми пробками и обвязывают сверху двойным слоем пергаментной бумаги.
К материалу, направляемому в лабораторию на исследование, обязательно прилагают документ, в котором указывают имя, отчество, фамилию и возраст больного, место, время взятия материала и его наименование, цель исследования, предполагаемый диагноз и т. д. В случае необходимости пересылки материала в отдаленные лаборатории банки укладывают в металлическую тару (биксы, ведра, кастрюли), перекладывают стружками, бумагой или ватой и помещают в деревянный ящик, который обвязывают, пломбируют или опечатывают сургучом. На крышке ящика чернилами или краской делают надпись: «Верх. Осторожно!» и в таком виде пересылают его в лабораторию с нарочным.
Для выявления вибриононосителей реконвалесцентам и здоровым лицам, соприкасавшимся с источниками инфекции или заразным материалом, дают слабительное (25—30 г сернокислой магнезии), чтобы собрать жидкие испражнения из верхней части кишечника. Пробы испражнений помещают в 1°/о пептонную воду.
Холерный вибрион вне организма человека довольно быстро погибает, поэтому, если невозможно исследовать материал в ближайшие 3 часа после его взятия, необходимо использовать консервирующую жидкость.
Состав и способ приготовления консервантов. 1.1% щелочная пептонная вода. Эта среда готовится из основного раствора пептона разведением ею дистиллированной водой в 10 раз.
Для получения основного раствора пептона смешивают в ступке 100 г сухого пептона, 50 г поваренной соли и 25 г углекислого натрия. Эту смесь растворяют при кипячении в 1 л дистиллированной воды- затем прибавляют 1 г азотнокислого калия. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут.
Пептонную воду разливают по пробиркам (по 10 мл) и во флаконы (по 50 мл) и стерилизуют, доведя предварительно pH до 8,2—8,4.
- Щелочная пептонная вода с теллуратом калия. Готовят рабочее разведение теллурита калия 1:1000. В 1% щелочную пептонную воду после автоклавирования добавляют рабочее разведение теллурита калия до конечной его концентрации 1 : 100 000. Среду готовят перед употреблением или не ранее чем за 24— 48 часов.
Теллурит калия выпускается в виде сухого порошка или 2% раствора во флаконах. Серии теллурита должны быть проверены на отсутствие ингибиторного действия к холерному вибриону.
- Щелочная таурохолатовая теллуритовая пептонная среда (жидкая среда Монсура). В 1 л дистиллированной воды при подогревании растворяют: триптиказы—10 г, хлористый натрий — 10 г, таурохолат — 5 г, карбонат натрия— 1 г. Доводят pH до 9,2, разливают во флаконы или сосуды с широким горлом и завинчивающимися пробками, автоклавируют при 1,5 атм в течение 15 минут и добавляют теллурит калия в конечной концентрации 1 : 100 000.
- Консервант Венкатрамена — Рамакришнана. Готовят основной раствор. В 80 мл горячей дистиллированной воды растворяют 12,4 г борной кислоты и 14,9 г хлористого калия, охлаждают и доводят до 1 л. Из основного готовят рабочий раствор следующим образом: 250 мл основного раствора смешивают с 133 мл 0,8% раствора едкого натра, перемешивают, доводят до 1 л дистиллированной водой и добавляют 20 г высушенной морской соли. Доводят pH жидкости до 9,2, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в широкогорлые склянки с привинчивающимися пробками и стерилизуют в автоклаве 15 минут при 120°.
Этапы микробиологического исследования. Этап I. а) Бактериоскопическое исследование. Из доставленного в лабораторию материала (испражнения, рвотные массы) готовят несколько мазков, высушивают на воздухе и фиксируют жидким фиксатором (этиловый спирт, смесь Никифорова). Фиксация жаром не рекомендуется. Часть мазков окрашивают водным фуксином, другую — по Граму. В окрашенных препаратах при микроскопировании наряду с типичными формами холерного вибриона в виде тонких и изогнутых палочек можно встретить кокковидные спиралевидные формы и палочки, сходные с микробами кишечно-тифозной группы. Результат бактериоскопического исследования является лишь ориентировочным.
б) Бактериологическое исследование. Испражнения, рвотные массы тщательно перемешивают и делают первичный посев на одну из жидких питательных сред и на твердые питательные среды. В качестве жидких сред обогащения рекомендуется 1% щелочная пептонная вода, 1 % пептонная вода с теллуритом калия и жидкая среда Монсура. Среды с теллуритом являются ингибирующими и при малых посевных дозах могут задержать размножение холерного вибриона. В качестве твердых питательных сред используют параллельно щелочный агар и одну из селективных сред (агар TCBS, среда Аронсона, среда Монсура). От больных с тяжелой формой холеры и от трупов в среду накопления достаточно посеять 0,1—0,2 мл испражнений, при легких формах заболевания 0,5—1 мл и от здоровых — 2—3 г испражнений.
Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° на щелочной пептонной воде 6—8 часов, на пептонной воде с теллуритом калия 12—24 часа, на щелочном агаре 10—12 часов, а на селективных средах 12—24 часа.
Бактериологическое исследование продолжается в последующих 6 этапах.
Этап II. 1. Просматривают посевы на 1-й среде накопления, изучают характер роста на ней.
При росте холерного вибриона на жидкой питательной среде уже через три часа с момента посева отмечается легкая опалесценция, а через 6 часов можно наблюдать появление тонкой нежной пленки, хорошо заметной на стенке пробирки при небольшом ее наклоне. В более поздние сроки (через 8—12 часов) образуются отчетливо видимая голубоватая пленка (при выделении вибрионов классического типа) или пленка беловатого цвета (при выделении вибрионов биотипа Эль-Тор). В процессе развития эпидемической вспышки холеры, а также в результате лечения больных антибиотиками могут возникнуть шероховатые варианты холерного вибриона (R-формы), образующие на поверхности жидкой питательной среды грубую, плотную либо сухую, сморщенную пленку.
- С поверхностной пленки на 1-й среде накопления готовят мазки, окрашивают и микроскопируют. При обнаружении микробов, сходных с холерным вибрионом, определяют их подвижность в препаратах висячей и раздавленной капли или путем посева уколом в 0,3% полужидкий агар глубиной на 2—2,5 см.
- При наличии достаточного количества вибрионов ставят реакцию иммобилизации с О-сывороткой в фазово-контрастиом освещении или темном поле.
- Производят пересев с 1-й среды накопления на 2-ю путем переноса примерно 0,1—0,5 мл среды поверхностного слоя в пробирку с 5—10 мл. той же среды.
6. С поверхностной пленки делают высев на агаровые среды. Посев на чашки делают петлей диаметром 5-6 мм, касаясь ею только поверхностного слоя жидкости.
Этап III. 1. Изучают рост на 2-й среде накопления и делают высев с нее на агаровые среды. Со 2-й средой накопления производят те же исследования, которые на
- этапе выполняют с 1-й средой накопления.
- Просматривают чашки с посевами нативного материала и отбирают колонии, подозрительные в отношении холерного вибриона.
- Отобранные колонии отсевают на лактозо-сахарозную среду.
- Материал других колоний с признаками, типичными для холерного вибриона, используют для ускоренной идентификации выделенных микробов.
Предварительная идентификация холерных вибрионов проводится, исходя из морфологии микробной клетки, морфологии колоний и ориентировочной реакции агглютинации на стекле с холерной О-сывороткой в разведении 1 :100 и типоспецифическими сыворотками в разведении 1:50.
При наличии характерных для холерных вибрионов признаков дают предварительный ответ о положительном результате исследования.
Этап IV. 1. Продолжают изучение колоний. Из посевов, сделанных на лактозо-сахарозную среду, отбирают культуры, расщепляющие сахарозу без газа и неферментирующие лактозу (покраснение среды в столбике без образования газа), для окончательной их идентификации.
Окончательная идентификация холерных вибрионов проводится на основании морфологии и тинкториальных свойств микробной клетки, культуральных свойств, биохимической активности, агглютинабельности видовой и типоспецифическими сыворотками и чувствительности к диагностическим фагам.
- Производят просмотр чашек с высевом с 1-й пептонной воды, отбор и изучение колоний, подозрительных в отношении холерного вибриона (см. этап III, пункт 2).
- Учет результатов ускоренной идентификации, проведенной на этапе III.
Этап V. 1. Учет окончательной идентификации культуры, выделенной с посева нативного материала. При
Холерные вибрионы с типичными свойствами вызывают в средах Гисса с маннозой и сахарозой образование кислоты без газа и не разлагают арабинозы. Признак ферментации углеводов не является специфическим только для холерных вибрионов и оценивается в сочетании с другими диагностическими признаками, в первую очередь с серологическими.
Протеолитические свойства выделенных культур учитываются на 2—3-и сутки. Холерный вибрион вызывает характерное воронкообразное разжижение желатины с пузырьком воздуха в верхней части (см. рис. 81). Однако встречаются такие холероподобные вибрионы, которые дают такую же картину разжижения желатины.
Определение антигенных свойств. Антигенные свойства выделенной культуры определяют, как это было указано выше, на предметном стекле или в развернутой агглютинации в пробирках. Цельную агглютинирующую холерную О-сыворотку (сухую предварительно растворяют в 1 мл дистиллированной воды) разводят физиологическим раствором, начиная с 1 :50 до титра. К 0,5 мл каждого полученного разведения сыворотки прибавляют по 0,5 мл взвеси исследуемой микробной культуры, содержащей 1 млрд. микробных тел в 1 мл по холерному стандарту мутности или 500 млн. по бактериальному стандарту ГКИ № 5. Таким образом, величина разведений сыворотки удваивается. Последнее разведение должно соответствовать титру сыворотки, указанному на этикетке. Реакция агглютинации, как обычно, сопровождается контролем антигена и контролем сыворотки. После перемешивания содержимого пробирок путем встряхивания штативов последние помещают на 2 часа в термостат при температуре 37°. По истечении указанного срока производят предварительный учет результатов. Окончательный учет результатов проводят через 20 часов выдерживания пробирок при комнатной температуре. Оценка полученных результатов ведется по общепринятой методике.
Для определения серотипа холерного вибриона ставят реакцию агглютинации на стекле с типовыми сыворотками Инаба и Огава, разведенными 1 :50, с контролем антигена в капле физиологического раствора. При положительной ориентировочной реакции агглютинации ставят развернутую реакцию с той же сывороткой, разведенной до титра.
Дифференциацию между вибрионами классического типа и вибрионами Эль-Тор проводят на основании лизируемости культур диагностическими бактериофагами С и Эль-тор II- чувствительности микробной культуры к полимиксину- реакции агглютинации куриных эритроцитов- гемолиза бараньих эритроцитов- реакции Фогес—Проскауэра- гексаминового теста.
Тесты с холерными бактериофагами. Для определения биотипов холерных вибрионов применяют холерные бактериофаги С и Эль-Тор II, выпускаемые медицинской промышленностью в жидком виде, в ампулах.
Для постановки реакции используют чашки Петри, залитые 1,5—2% питательным агаром pH 7,4—8,0. После предварительного подсушивания питательной среды дно чашки делят на секторы по количеству 10-кратных разведений фага (начиная от цельного до рабочего) указанного на этикетке ампулы. В пробирку с 3 мл 6,0% агара Хоттингера, расплавленного и охлажденного до температуры 46°, добавляют 0,1—0,2 мл 3—4-часовой бульонной культуры изучаемого штамма вибриона, культуру тщательно перемешивают и выливают на поверхность агара в чашку Петри. После застывания слоя агар чашки подсушивают 30 минут при комнатной температуре и затем в центр секторов наносят петлей диаметром 2—3 мм по капле разведений на одну чашку фагов С, на другую — фагов Эль-Тор II. Для подсыхания капель фага чашки выдерживают при комнатной температуре 15—20 минут, затем перевертывают кверху дном и помещают в термостат при 37°. Результаты учитывают через 12—16 часов, в экстренных случаях — через 4—6 часов.
Бактериофаг С активен только в отношении классического варианта холеры, бактериофаг Эль-Тор II действует только на вариант Эль-Тор.
Чувствительность к полимиксину. Чувствительность микробных культур к полимиксину определяется посредством посева исследуемой микробной культуры на чашки питательного агара pH 7,6, содержащего полимиксин М или В, из расчета 50 ЕД антибиотика на 1 мл среды.
Результаты роста учитывают после инкубации посевов при температуре 37° в течение 18 часов. Вибрионы Эль-Тор растут на полимиксиновой среде, классические холерные вибрионы на ней не растут.
Реакция гемагглютинации с куриными эритроцитами. На предметное стекло помещают каплю физиологического раствора и растирают в ней петлю 18-часовой агаровой культуры исследуемых вибрионов до получения густой взвеси, затем добавляют каплю 2,5% взвеси куриных эритроцитов, отмытых дважды физиологическим раствором. Взвесь эритроцитов и вибрионов смешивают легким покачиванием стекла. Реакция сопровождается двумя контролями — 2,5% взвесью эритроцитов, размешанной в капле физиологического раствора (контроль эритроцитов), и взвесью испытуемых вибрионов в капле физиологического раствора (контроль антигена).
При положительном результате реакции (при отрицательных контролях) склеивание эритроцитов происходит в течение минуты.
Холерные вибрионы биотипа Эль-Тор агглютинируют куриные эритроциты, классические холерные вибрионы не вызывают их агглютинации.
Гемолиз бараньих эритроцитов (проба Грейга). К 1 мл суточной культуры испытуемых вибрионов, выращенных на бульоне Мартена или Хоттингера, добавляют 1 мл 1% взвеси стерильно взятых эритроцитов барана. Смесь культуры и эритроцитов осторожно перемешивают и помещают на 2 часа в термостат при 37°, а затем до следующего дня выдерживают в холодильнике. После этого учитывают результат реакции. Растворение эритроцитов (лаковая кровь) при отсутствии гемолиза в контрольной пробирке (взвесь эритроцитов в стерильном бульоне) отмечается как положительный результат реакции.
Признак гемолиза не является специфическим только для холерных вибрионов, так как многие нехолерные вибрионы обладают способностью вызывать гемолиз эритроцитов.
Реакция Фогес—Проскауэра. Реакция заключается в способности микробной культуры образовывать ацетилметилкарбинол. Для ее выявления исследуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка (0,5 г пептона, 0,5 г глюкозы и 0,5 г фосфорнокислого калия растворяют в 100 мл дистиллированной воды). После 1—3 суток инкубирования посева в термостате при температуре 37° к 1 мл исследуемой культуры добавляют 0,6 мл 2-нафтола (6% раствор в абсолютном
спирте) и 0,2 мл 4%. раствора едкого кали. Пробирки встряхивают и помещают на 1 час в термостат.
При положительном результате реакции, свойственном вибрионам Эль-Тор, наступает розовое или рубиново-красное окрашивание среды, являющееся следствием образования ацетилметилкарбинола.
Гексаминовый тест. Из суточной агаровой культуры исследуемого вибриона делают высев в 1 мл бульона Хоттингера или Мартена pH 7,6. Посев инкубируют в термостате при температуре 37° в течение 24 часов, после чего одну петлю (диаметром 0,3 мм) микробной взвеси переносят в 1 мл глюкозо-гексаминовой среды. Засеянные среды помещают в термостат при температуре 37°. Результаты учитывают через 6—24 часа. Вибрионы Эль-Тор в течение 6—8 часов изменяют цвет среды из зеленого в желтый. Классический холерный вибрион в течение этого времени не изменяет цвета среды, но цвет среды может измениться в более поздние сроки.
Первые три теста (лизируемость диагностическими бактериофагами, чувствительность к полимиксину и способность культур агглютинировать куриные эритроциты) являются основными, а остальные — вспомогательными.
Таким образом, окончательная идентификация выделенных микробных культур, подозрительных на холерный вибрион, основывается на комплексе признаков, пе: речисленных в табл. 19.
Метод иммобилизации вибрионов под влиянием специфической холерной О-сыворотки и типовых холерных бактериофагов. Метод иммобилизации и микроагглютинации вибрионов под влиянием специфической холерной О-сыворотки и типовых холерных бактериофагов дает возможность поставить диагноз в течение нескольких минут при концентрации возбудителя не менее 4,3Х10 клеток в 1 мл исследуемого материала.
Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15—20 минут от начала исследования.
Специфическая профилактика и терапия. Специфическая профилактика холеры достигается иммунизацией населения моновакциной из убитых фенолом холерных вибрионов. Для лечения с успехом применяют специфический холерный бактериофаг и антибиотики (тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин).
Питательные среды для выращивания холерных вибрионов.
- Щелочной агар. К 1 л обычного мясо-пептоппого агара добавляют 30 мл 10% раствора углекислого натрия, кипятят 45 минут, проверяют реакцию (pH 7,8—8,0), разливают по флаконам и пробиркам и стерилизуют в автоклаве 20 минут при 120°. Срок хранения 3 месяца в прохладном месте.
- Бакто-агар TCBS. Сухая среда для диагностики холеры (pH 8,6). На 1 л дистиллированной воды берут 89 г сухой среды, нагревают до кипения (до полного растворения). Среду, не стерилизуя, разливают в чашки. Сопутствующая микрофлора на этой среде, как правило, не растет, за исключением некоторых видов протея, образующих колонии темно-желтого цвета.
- Среда Аронсона. Мясо-пептонный 3% агар проваривают в течение 4—5 часов в аппарате Коха. К 100 мл горячей среды добавляют 5—6 мл 100% раствора безводной углекислой соды и стерилизуют 10—15 минут при температуре 100°, после чего к 100 мл горячей среды добавляют 5 мл 20% раствора сахарозы и 5 мл 20% раствора декстрина, предварительно простерилизованного в автоклаве или фильтрацией, 0,4 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл свежеприготовленного 10% раствора сульфита натрия, предварительно простерилизованного кипячением. Готовую среду остужают до температуры 45—50°, разливают по чашкам.
- Среда Мон сура (щелочная таурохолатовая теллуритовая желатиновая среда). В 1 л дистиллированной воды в кипящей водяной бане вначале растворяют 10 г хлористого натрия и 15 г агар-агара, затем, часто помешивая, триптиказы — 10 г, таурохолата натрия — 5 г, карбоната натрия — 30 г и желатины Дифко — 1 г. Доводят pH до 8,5, разливают по 20 мл в колбы с притертыми пробками и стерилизуют при 1,5 атм. 15 мииут. Среду хранят в прохладном месте.
Перед разливом ее в чашки добавляют теллурит калия в концентрации 1 : 200 000. Чашки со средой можно использовать в течение 5 дней. Колонии протея на этой среде имеют сероватый центр и помутнения краев у них не наблюдается.
- Лактозо-сахарозная (полиуглеводная) среда. В 1 л дистиллированной воды при подогревании растворяют: пептона — 0,5 г, хлористого натрия — 0,5 г, лактозы—1 г, сахарозы — 0,1 г, агар-агара — 1 г. Добавляют индикатора Андреда 4 мл, устанавливают pH — 7,4, разливают в пробирки высоким столбиком и стерилизуют в автоклаве при температуре 112° в течение 20 минут. Готовая среда после стерилизации скашивается как среда Ресселя и посев на нее производят по общепринятой методике.
Холерные и холероподобные вибрионы, расщепляя сахарозу, дают покраснение в столбике без образования газа. Дизентерийные и тифо-паратифозные бактерии не изменяют цвета среды. Кишечная палочка образует кислоту с газом как в столбике, так и в скошенном участке среды.
- Глюкозо-гексаминовый бульон. Кристаллический гексамин (уротропин) в количестве 1 г добавляют к 100 мл питательного бульона pH 7,1. В другой флакон со 100 мл такого же бульона добавляют 1 г глюкозы. Оба 1% раствора стерилизуют путем фильтрации через бактериальные свечи и хранят при температуре 10°. Перед постановкой реакции от 100 мл раствора глюкозы стерильно берут 50 мл и добавляют 50 мл раствора гексамина. На
100 мл глюкозо-гексаминового бульона добавляют 0,1 мл 1,6% спиртового раствора индикатора бромтимолового синего, Среда должна иметь травянисто-зеленый цвет.
- Среда Кодама. В 100 мл воды растворяют 1 г пептона, 0,5 г растворимого крахмала, устанавливают pH 7,4, разливают в стерильные пробирки по 5 мл и стерилизуют дробно при температуре 100° в течение 3 дней по 20 минут.
