Ферменты - микробиология с техникой микробиологических исследований
Микроорганизмы, как и всякие клетки, осуществляют обмен веществ (питание и дыхание) при помощи ферментов— биологических катализаторов. Без ферментов нет жизни микробной клетки. С подавлением активности ферментов связан переход микробов в анабиотическое состояние, с активированием ферментов — развитие жизнедеятельности клетки, прорастание спор, усиление интенсивности роста и размножения. По своим свойствам и характеру действия ферменты бактерий сходны
с ферментами, образующимися в клетках и тканях растений и животных.
Биологическое значение гидролитических ферментов заключается в том, что они осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции. В результате этих реакций такие соединения, как жиры, расщепляются на жирные кислоты и глицерин, полисахариды— на моносахариды, белки — в конечном итоге на аминокислоты. Распад белков вызывают ферменты — протеазы, углеводов — карбогидразы, жиров — эстеразы. Ферменты, выделяемые микробами во внешнюю среду, называются экзоферментами. Благодаря их действию сложные соединения расщепляются на более простые, доступные усвоению. Большинство ферментов является внутриклеточными — эндофермент ам и. Они обусловливают пластическую деятельность микроорганизмов и синтез сложных соединений в клетке.
Так как процессы гидролитического распада питательных субстратов происходят вне бактериальной клетки, вся выделенная при этом энергия теряется для нее. В противоположность этому эндоферменты активны внутри клетки, и энергия, освобождающаяся в ходе этих реакций, используется бактерией для осуществления жизненных функций.
Количество ферментов у разных микроорганизмов различно. Ферменты в своем действии на различные вещества отличаются строгой специфичностью. Например, фермент мальтаза расщепляет только мальтозу, лактаза—только лактозу и т. д. Изучение ферментативной способности микробов играет большую роль при определении видов (идентификации) микроорганизмов. Например, для дифференциации брюшнотифозной палочки ее от морфологического «двойника» кишечной палочки используют способность последней сбраживать лактозу, так как известно, что возбудитель брюшного тифа этой способностью не обладает.
Биохимические свойства микробов
Изучение культуральных свойств не может быть решающим при определении вида микроба. При росте микробов на питательных средах происходят разнообразные химические процессы, обусловленные фермента
тивной деятельностью бактерий. Одни из ферментов расщепляют белки и углеводы, другие вызывают реакцию окисления и восстановления. Изменениями, наступающими в среде под действием ферментов, пользуются для целей диагностики.
Определение протеолитической способности микробов. Многие микробы в процессе жизни выделяют ферменты, расщепляющие белки, так называемые протеолитические ферменты. Способов определения их существует много. Наиболее простым способом является посев уколом в столбик желатины. Разжижение ее свидетельствует о наличии протеолитического фермента. Желатина разжижается стафилококками, холерным вибрионом, сибиреязвенной бациллой и некоторыми другими микроорганизмами. Протеолиз можно наблюдать при посеве на свернутую лошадиную сыворотку и в молоко. В первом случае протеолиз выражается разжижением и образованием углублений на поверхности среды, во втором наблюдается просветление молока или растворение свертка казеина. Процесс расщепления белка может доходить до образования индола, аммиака и сероводорода.
Определение индола. 1. Способ Эрлиха — Беме. Для определения индола по этому методу необходимо иметь: раствор 1, состоящий из 4 г парадиметиламидобензальдегида, 380 мл 90° спирта, 80 мл соляной кислоты- раствор 2— насыщенный при нагревании раствор персульфата калия (K2S2O2). Техника определения индола следующая. К бульонной культуре прибавляют 1—2 мл эфира, основательно встряхивают и прибавляют по стенке пробирки 1—2 мл раствора 1 и столько же раствора 2. В присутствии индола не позднее чем через 5 минут должно появиться красное окрашивание всего эфирного слоя или нижней его части (рис. 39).
Красное окрашивание в бульоне при бесцветном эфире не принимается в расчет.
Видео: Вирусы, от которых нет лекарств. Битва за жизнь. Вирусы без границ // Затвра не умрет никогда
- Способ Мореля. Фильтровальную бумагу обильно смачивают горячим водным насыщенным (12%) раствором щавелевой кислоты, высушивают в термостате и нарезают на полоски шириной 0,5 см. Полоску бумаги помещают в засеянную пробирку с бульоном Хоттингера или пептонную воду (фиксируют полоску одним концом под ватной пробкой таким образом, чтобы она не
касалась среды). После этого пробирку ставят в термостат. При образовании индола часть бумажки окрашивается в розовый цвет через 1—3 дня. Появление окраски следует наблюдать при проходящем свете.
Определение сероводорода. Конечным продуктом распада белка является сероводород (H2S). Для его обнаружения в культуре пользуются полоской фильтровальной бумаги, смоченной уксуснокислым свинцом. Такую бумажку помещают под ватную пробку в пробирку с засеянной испытуемой культурой на бульоне. Если культура вырабатывает сероводород, то бумажка буреет или чернеет от образующегося сернистого свинца (см. рис. 39).
Определение ферментации сахаров. Многие микробы обладают способностью разлагать углеводы с образованием кислот и газов. Для того чтобы обнаружить процессы разложения тех или иных сахаров, применяют цветной ряд (среда Гисса). В пробирку со средой опускают запаянную с одного конца трубочку (поплавок) для обнаружения газа. Можно также пользоваться полужидкой средой Гисса без поплавка. Если микроб в процессе жизни разлагает тот или иной углевод с образованием кислоты, то наблюдается изменение цвета среды, причем поплавок остается на дне. На присутствие газа указывает разрыв полужидкого агара или образование газа в поплавке (см. рис. 24 на вклейке).
Рис. 24. Рост брюшнотифозной палочки на средах с углеводами.
1 — лактоза- 2 — глюкоза- 3 — мальтоза- 4 — маннит- 5 — сахароза.
1 — Эрлиха (образование индола)- 2—на сероводород.
Определение редуцирующей способности. Редуцирующей способностью называется способность микробов обесцвечивать органические краски, превращая их в бесцветные лейкопродукты. Для определения редуцирующей способности употребляют метиленовый синий, тионин, лакмус, индигокармин, нейтральрот и т. д.
Исследование редуцирующей способности микроорганизмов производится следующим образом. К питательным средам — бульону или агару — прибавляют указанные выше растворы красок и производят посев испытуемой культуры. В процессе роста при наличии
у микробов редуцирующей способности наблюдается обесцвечивание среды.
Определение каталазы. Многие микробы вырабатывают фермент каталазу. Каталаза разлагает перекись водорода с образованием воды и неактивного кислорода. Наиболее простым методом определения каталазы является следующий. На поверхность 24-часовой культуры на скошенном агаре наливают 1 мл перекиси водорода и ставят пробирку наклонно. Если получаются пузырьки газа, то это значит, что каталаза имеется и реакция считается положительной. Если пузырьки не образуются, реакция считается отрицательной.
