Принципы культивирования микроорганизмов - микробиология с техникой микробиологических исследований
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
- Посев на скошенный агар штрихом. Правой рукой берут петлю и прожигают ее на пламени горелки докрасна. Левой рукой между большим и указательным пальцами держат пробирку с агаром почти в горизонтальном положении, чтобы во время посева в нее не попадали микробы из воздуха. Легким вращательным движением освобождают ватную пробку и мизинцем правой руки, прижимая к ладони, вынимают ее из пробирки. Край пробирки слегка обжигают. Петлей забирают немного материала, содержащего микробов, и зигзагообразными движениями наносят на поверхность агара в пробирке. После произведенного посева петлю извлекают из Пробирки, обжигают ее края и закрывают ватной пробкой. Затем снова прожигают петлю в пламени горелки, чтобы уничтожить оставшихся на ней микробов.
- Пересев на скошенный агар. Материал, содержащий микробов, также находится в пробирках. Для того чтобы сделать пересев из одной пробирки в другую, обе пробирки, т. е. ту, из которой производится посев, и ту, которая подлежит засеву, берут вместе и держат между большим и указательным и средним пальцами левой руки. Вынимают сначала пробки из пробирок по указанной выше методике, набирают материал и переносят материал на поверхность стерильного агара, где и производят посев, затем обжигают края пробирки и закрывают (рис. 33).
- Посев на бульон. Посев на бульон или с бульона на бульон или агар делают так же, как и посев на агар, но все манипуляции следует производить осторожно, чтобы бульон не вылился из пробирки или не смочил ее краев. Материал, внесенный в бульон для посева, растирают на стенке пробирки ближе к жидкости и взбалтывают в бульоне. Пересев из бульона в бульон можно делать также при помощи стерильной пастеровской пипетки.
- Посев в молоко и другие питательные (жидкие) среды производится так же, как и посев в бульон.
- Посев уколом в столбик агара или желатины. Пробирку с агаром или желатиной держат дном кверху. Материал, подлежащий посеву, берут платиновой иглой, которую отвесно вкалывают в поверхность агара или желатины и продвигают по оси пробирки до самого дна. Иглу затем извлекают, обжигают и закрывают пробирку пробкой (рис. 34).
Во внешней среде и в организме человека микробы чаше всего встречаются в смеси с другими микробами. Для изучения свойств того или иного микроба (без чего не может быть поставлен диагноз) его нужно иметь в чистой культуре, т. е. приходится отделять его от других микробов, с которыми он смешан.
Рис. 33. Посев петлей.
Рис. 34. Посев уколом.
Рис. 35. Заливка чашки агаром.
Существуют следующие методы выделения чистых культур бактерий:
а) посев на среду в чашку Гейденрейха — Петри-
б) биологические методы (применение элективных сред, использование различных оптимальных температур, заражение лабораторных животных). Наиболее часто пользуются посевом исследуемого материала на среду в чашки Гейденрейха — Петри.
- Техника посева на чашку Гейденрейха — Петри с застывшим агаром. Агар в колбах, флаконах, пробирках расплавляют в кипящей водяной бане. Затем агар охлаждают до 50—60° и разливают в чашки Гейденрейха — Петри. Чашки должны быть стерильными. Их устанавливают на горизонтальной поверхности, и из сосуда, содержащего расплавленный агар, вынимают пробку, края сосуда обжигают, после чего среду выливают в чашку (рис. 35). Крышку чашки приподнимают левой рукой с одной стороны, не открывая чашки полностью. Слегка наклоняя чашку в разные стороны, распределяют налитый в нее агар ровным слоем по всему дну. Когда агар затвердеет, чашки ставят в термостат вверх дном для подсушивания. Полезно также удалить стерильной ватой конденсационную воду, собирающуюся на крышке чашки. Посев на чашки с агаром производят штрихом при помощи петли или втиранием стеклянным шпателем. Для его изготовления стеклянную палочку необходимой толщины (4— 5 мм) вводят в пламя горелки, нагревают до размягчения, конец обжимают предварительно нагретыми плоскозубцами и придают форму треугольника (рис. 36). Практически удобнее пользоваться металлическими шпателями Дригальского.
Посев петлей производится следующим образом. Платиновой петлей набирают небольшое количество материала, легко проводят по поверхности агара, нанося ряд параллельных линий. Той же петлей, не набирая материала, вновь наносят штрихи на второй и третьей чашке с агаром. На первой чашке может получиться сплошной рост, тогда как на второй и третьей наблюдается рост единичных, изолированных колоний. Каждая колония представляет обособленное скопление однородных микробов. Можно также пользоваться одной чашкой, разделив ее на несколько секторов, нанеся линии деления по стеклу дна чашки.
Рис. 36. Шпатель Дригальского.
Каждый отдельный сектор будет заменять одну чашку. При последующем пересеве из колоний на косой агар или другую питательную среду получают чистую культуру.
При посеве шпателем на поверхность агара наносят петлей одну каплю исследуемого материала. Затем, приоткрыв чашку, прокаленным и остуженным стеклянным шпателем растирают каплю по всей поверхности, производя легкие поглаживающие движения по всей поверхности агара (рис. 37). Не обжигая шпателя, им же засевают вторую и третью чашки с агаром.
Рис. 37. Посев шпателем.
Биологические методы выделения чистых культур. Выделение чистых культур на основе различных биологических свойств бактерий широко проводится на специальных питательных средах. Например, специальные среды нашли широкое применение при выделении возбудителей кишечных инфекций. Добавление к питательной среде малахитового или бриллиантового зеленого, солей желчных кислот, значительных концентраций поваренной соли или лимоннокислых солей подавляет рост кишечной палочки и не влияет на размножение патогенных бактерий кишечнотифозной группы. Для выделения из мокроты и слизи культуры коклюшной палочки к питательной среде добавляют антибиотик пенициллин, который угнетает рост сопутствующей микрофлоры и в то же время не задерживает роста и размножения возбудителя коклюша. Для выделения холерного вибриона используют элективную среду — пептонную воду, а для выделения дифтерийной палочки — свернутую лошадиную сыворотку.
Для облегчения выделения чистых культур некоторых бактерий можно воспользоваться и тем, что они растут при различных температурных оптимумах. В качестве примера можно привести метод выделения чистой культуры кишечной палочки из воды путем выращивания посевов в термостате при температуре 43°, выделение возбудителя чумы из загрязненного материала путем выращивания при 20° и даже при 5°.
Наконец, следует указать, что рост некоторых патогенных бактерий (пневмококк, бациллы сибирской язвы, бактерии туляремии и др.) можно получить в чистой культуре, заражая лабораторных животных, чувствительных к тому или другому микробу. Например, для выделения культуры пневмококка из мокроты больного человека производится заражение белой мыши.
Термостат
Рис. 38. Термостаты.
Засеянную среду помещают в термостат, где температура наиболее благоприятна для выращивания микробов. Для патогенных микробов эта температура должна соответствовать температуре человеческого тела, т. е. 37°. Электрические термостаты с автоматическим регулированием температуры бывают различных размеров— от величины небольшого ящика до величины комнаты. Термостат для обычной бактериологической работы представляет собой шкаф с двойными стенками из металла или дерева, обшитый снаружи плохими проводниками тепла, например, пробкой, асбестом и т. п. (рис. 38). Термостат имеет двойную дверку, наружную, обшитую изолирующим слоем, и внутреннюю в виде рамки со стеклом. Внутри термостата устроены съемные полки из металлической сетки.
