Бруцеллы - микробиология с техникой микробиологических исследований
Рис. 94. Бруцеллы в чистой культуре.
Окраска бруцелл по Козловскому. Фиксированный препарат окрашивается при подогревании 2% водным сафронином (до появления пузырьков), охлаждается, промывается водой и докрашивается 0,75—1% водным раствором малахитовой зелени в течение 17а—2 минут- бруцеллы сохраняют красный цвет сафронина, а остальные бактерии и клеточные элементы окрашиваются в зеленый цвет.
Культуральные и биохимические свойства. Бруцеллы хорошо растут на обычных питательных средах в аэробных условиях. Однако у возбудителя аборта коров—» Br. abq^tus bovis выражены микроаэрофильные свойства: первые генерации этого микроба размножаются исключительно в атмосфере, содержащей 5—10% углекислоты, и только последующие пересевы дают хороший рост в обычных условиях.
На чашках с агаром вырастают мелкие, как капельки росы, круглые выпуклые колонии, постепенно увеличивающиеся до 2—3 мм в диаметре. Эти колонии имеют обычно гладкое строение (S-форма), мутноваты, с беловатым перламутровым блеском. В процессе диссоциации появляются шероховатые формы (R-формы), которые отличаются от S-формы рядом признаков (табл. 22). На скошенном агаре вырастают мелкие изолированные колонии, которые в дальнейшем сливаются, образуя серовато-белый полупрозрачный налет. Выращивание на агаре с 5% глицерина или печеночной среде улучшает рост бруцелл.
Бруцеллы
Основныепризнаки | S-формы | R-формы |
Ростна агаре | Нежный,влажный | Болеегрубый и сухой |
Видколоний | Круглые,выпуклые, правильно контурированные, гомогенные или нежнозернистые | Круглые,менее выпуклые, иногда неправильно контурированные, грубозернистые сзеленоватым металлическим оттенком |
Ростна бульоне | Гомогенный,без просветления | Хлопчатый,с осадком и просветлением |
Взвесьв физиологическом растворе | Суспензиягомогенная, стойкая | Суспензиянеравномерная, нестойкая |
Термопреципитациясуспензии при 90° | Отрицательная | Положительная |
Агглютиногенность | Оченьхорошая | Плохая |
Вирулентность | Высокая | Какправило, отсутствует |
В бульоне бруцеллы дают общее помутнение с последующим образованием слизистого осадка на дне, желатины не разжижают, молока не свертывают, углеводов не разлагают. Ферментируют белки с образованием аммиака и сероводорода, восстанавливают нитраты в нитриты.
Антигенная структура. Бруцеллы обладают двумя общими соматическими антигенами А и М, так что провести резкую грань между ними при помощи реакции агглютинации не удается. В зависимости от типа бруцелл оба антигена находятся внутри клетки в различных соотношениях. Так, у Вг. melitensis преобладает антиген М, а у Br. abortus bovis и Br. abortus suis— антиген А. В последнее время у бруцелл обнаружен Vi- антиген.
Резистентность. При воздействии температуры 60° бруцеллы погибают в течение часа. 1% раствор карболовой кислоты убивает их в течение 15 минут. В высохшей моче они могут сохраняться до 22 дней.
Патогенность для животных и токсинообразование. К бруцеллам восприимчивы морские свинки, белые мыши, крысы и кролики. В естественных условиях бруцеллез встречается у коз, овец, свиней и коров.
Экзотоксина бруцеллы не образуют. Ядовитое вещество микробных клеток относится к эндотоксинам.
Патогенез и клиника. Источником инфекции при бруцеллезе является крупный и особенно мелкий рогатый скот (козы, овцы) и свиньи. Заражение человека происходит в результате непосредственного контакта с заразным материалом (чаще всего при уходе за скотом) или в результате употребления в пищу молока, молочных продуктов и мяса от зараженных животных, если эти продукты не подвергались тепловой кулинарной обработке.
Известны многочисленные случаи заражения через свежий овечий сыр — брынзу.
Входными воротами инфекции являются желудочно-кишечный тракт, кожные и слизистые покровы. На месте входных ворот бруцеллы не вызывают никаких воспалительных явлений и проникают в регионарные лимфатические узлы, которые поражают. В этих узлах бруцеллы интенсивно размножаются, а затем в результате «прорыва» регионарного лимфатического барьера, гематогенным путем распространяются по всему организму, вызывая первичную генерализацию инфекции. Током крови бруцеллы заносятся во внутренние opгaны (селезенку, лимфатические узлы, костный мозг и др.), где образуются метастатические очаги. В последних при обострении процесса вновь происходит размножение бруцелл, которые, попав в кровь, обусловливают рецидивы генерализации инфекции. Инкубационный период продолжается от 7 до 21 дня. Заболевание развивается постепенно. Типичным проявлением инфекции служит ундулирующая лихорадка: температурная кривая носит волнообразный (ундулирующий) характер. Бруцеллез протекает как хронически рецидивирующая инфекция с весьма разнообразной клинической картиной (поражение нервов, суставов, костей, легких, глаз, печени, селезенки и других органов). У беременных может наступить аборт. Встречаются атипичные, легкие формы бруцеллеза, дающие только небольшое повышение температуры.
Болезнь может длиться от нескольких месяцев до нескольких лет и заканчивается самоизлечением — выздоровлением (П. Ф. Здродовский).
Из организма больных бруцеллы выделяются с мочой, а у кормящих женщин также с молоком.
Иммунитет. Перенесенное заболевание оставляет попе себя относительный иммунитет. В крови больных обнаруживаются агглютинины, преципитины и комплечент-связывающие антитела. Уже в начале заболевания, в острой его стадии начинается иммунологическая перестройка организма, в результате чего острый процесс переходит в хронический, затем в латентное состояние и наконец наступает самоизлечение.
В иммуногенезе при бруцеллезе играют роль не только гуморальные факторы, но, как показали эксперименты П. А. Вершиловой на животных, повышение барьерной функции лимфатических узлов. Установлено также, что при бруцеллезе имеет место усиление фагоцитоза, которое обнаруживается постановкой опсоно-фагоцитарной реакции.
Течение бруцеллеза у человека и животных сопровождается аллергической перестройкой организма, которая выражается в повышении чувствительности инфицированного организма к бруцеллам и их токсинам Исходя из этого, для диагностики бруцеллеза применяется аллергическая проба Бюрне.
Микробиологическая диагностика. Бруцеллез относится к особо опасным инфекциям и поэтому бактериологическая диагностика может проводиться лишь в специальных учреждениях.
Материалом для лабораторного исследования могут быть кровь, пунктат костного мозга грудины, моча, молоко (для обнаружения возбудителя) и сыворотка больного (для обнаружения антител).
Метод гемокультуры позволяет выделить бруцеллы с первых дней заболевания. Кровь, полученную венепункцией, засевают по 10 мл в две колбы с 100—200 мл мясо-пептонного или печеночного бульона. Лучшие результаты получаются при добавлении к бульону 1% глюкозы и 2% глицерина.
Для роста Br. abortus bovis необходимо создать повышенную концентрацию углекислоты. Последнее достигается простым приемом. Ватную пробку, закрывающую колбу, зажигают и вталкивают в глубину горлышка, которое затем плотно закрывают сверху резиновой пробкой.
Засеянные колбы (одна с обычным бульоном, а другая с повышенной концентрацией углекислоты) помещают в термостат при 37°, через 7—8 дней или несколько позже наступает рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжах фибрина. Бульон при этом либо слегка мутнеет, либо остается прозрачным. При наличии роста на бульоне производится высев на чашку с печеночным агаром и агаром Д. Сухой питательный агар Д повышает высеваемость бруцелл и состоит из питательного бульона, дрожжевого автолизата и хлористого натрия. Так как бруцеллы в первых генерациях обладают замедленным ростом, посевы следует выдерживать в термостате не менее месяца и каждые 5—7 дней делать высев на чашку с печеночным агаром. Из выросших колоний отвивают чистые культуры, идентификация которых завершается реакцией агглютинации с бруцеллезной иммунной сывороткой. При дифференциации типов бруцелл учитывают отношение
Таблица 23
Условия выращиванияв первых генерациях | Бактериостатическоедействие красок | Выделение сероводорода | |||
Культура | фуксин 1:25 000 | тионин 1:25 000 | пиронин 1:200 000 | ||
Brucellamelitensis | Аэробно | + | + | + | |
Brucella suis. | То же | — | + | — | + |
Brucella abortusbovis | При 5-10% С02 | + | + | + ИЛИ— | |
Условные обозначения: + наличие роста или выделение сероводорода- — отсутствие выделения роста или отсутствие выделения сероводорода.
первой генерации культуры к углекислому газу, способность их вырабатывать сероводород на печеночном агаре и рост на плотных средах, к которым добавлены некоторые анилиновые краски в определенных концентрациях (табл. 23).
Для выделения миелокультуры пунктат костного мозга, взятый шприцем из грудины, исследуют так же как кровь на гемокультуру. Миелокультура выделяется в 1/2—2 раза чаще, чем гемокультура. Для получения уринокультуры мочу берут асептически катетером, центрифугируют. Осадок засевают на чашки с агаром, к которому добавляют генцианвиолет в разведении 1:200 000 для подавления роста грамположительной флоры.
Наибольшую высеваемость бруцелл удается получить при посевах исследуемого материала в желток свежего куриного яйца или в желточный мешок куриного эмбриона. Кровь разводят 1:3 цитратным бульоном и в количестве 0,1—0,2 мл вводят в несколько яиц. (Техника заражения яиц описана в главе «Вирусы» стр. 385.) Зараженные яйца ставят в термостат на 5 дней при 37°, а затем 0,3 или 0,5 мл содержимого яиц засевают на плотные и жидкие питательные среды, посевы исследуют каждые 2—3, дня.
Большое диагностическое значение имеет серологическая диагностика — реакция агглютинации Райта.
Реакция Райта. Эта реакция специфична. Она проявляется уже в первые дни заболевания и может долгое время сохраняться по исчезновении симптомов бруцеллеза.
Реакцию Райта ставят при бруцеллезе по методике реакции Видаля. В качестве антигена для реакции употребляют убитую взвесь бруцелл, содержащую 1 млрд. бактерийных тел в 1 мл, для этого диагностикум, содержащий 10 млрд. микробных тел, разводят перед употреблением 1:10. Реакцию Райта ставят всегда с двумя контролями.
- Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой.
- Контроль антигена ставят в одной пробирке при любом числе испытуемых сывороток.
Пробирки ставят на 4 часа в термостат при 37°, после чего производят первый учет- вторично учет производят после 18—20 часов стояния при комнатной температуре. Положительная реакция при титре 1 : 50 считается сомнительной, при титре 1:100 — слабо положительной, при титре 1 200 и 1 400 — положительной и при титре 1 800 и выше — резко положительной.
Реакция Хеддльсон а—Кайтмазовой. Ускоренный метод серодиагностики предложил в 1926 г. Хеддльсон. Модификация Хеддльсона не имела широкого применения до тех пор, пока Е. И. Кайтмазова не усовершенствовала и не рационализировала ее. Для постановки реакции Хеддльсона—Кайтмазовой нужны следующие ингредиенты: 1) сыворотка больного, 2) физиологический раствор, 3) диагностикум (цветной). Суть этой простой и высокочувствительной реакции агглютинации заключается в следующем (табл. 24).
Таблица 24 Схема реакции Хеддльсона — Кайтмазовой
Первый квадрат | Второй квадрат | Третий квадрат |
0,08 мл сыворотки 0,03 мл антигена 0,01 мл сыворотки0,03 мл антигена | 0,04 мл сыворотки 0,03 мл антигена 0,02 мл сыворотки0,03 мл физиологического раствора (контроль сыворотки) Пятый квадрат | 0,02 мл сыворотки 0,03 мл антигена 0,03 мл антигена0,03 мл физиологического раствора (контроль антигена) Шестой квадрат |
Обычное стекло (размером 20X15 см) расчерчивают на шесть квадратов. В первые пять квадратов наносят микропипеткой сыворотку больного в количестве 0,08- 0,04- 0,02- 0,01- 0,02 мл, в шестой — 0,03 мл диагностикума. В первые четыре квадрата добавляют по 0,03 мл диагностикума, в пятый и шестой — 0,03 мл физиологического раствора. Все капли осторожно перемешивают стеклянной палочкой по направлению от большего разведения к меньшему, а затем стекло слегка подогревают над пламенем горелки в течение 3 минут. В случае положительной реакции появляются отчетливые хлопья (агглютинация). Длительность наблюдения от 5 до 8 минут. Для диагностики бруцеллеза применяют также реакцию связывания комплемента, ставят опсодо-фагоцитарную пробу.
Аллергическая проба Бюрне. С целью диагностики, начиная с 8—10-го дня заболевания, применяют внутрикожную аллергическую пробу по Бюрне. В качестве антигена употребляют бруцеллин (или мелитин)— стерильный фильтрат из 3—4-недельных бульонных культур бруцелл. При положительной реакции через сутки на месте введения бруцеллина (его вводят 0,1 мл внутрикожно в среднюю часть сгибательной поверхности предплечья) появляется краснота и болезненный отек размером 4—6 см (рис. 95 на вклейке).
Рис. 95. Аллергическая проба Бюрне (положительная).
Среди специфических методов лечения бруцеллеза вакцинотерапия убитой бруцеллезной вакциной практически занимает ведущее место. Из других средств применяют сульфаниламидные препараты (норсульфазол, сульфатиазол, стрептоцид) и антибиотики (стрептомицин, биомицин, синтомицин и левомицетин).
