Подготовка посуды, приготовление физиологического раствора - микробиология с техникой микробиологических исследований
ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ, ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВАТНЫХ ПРОБОК И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА
Посуда. Стеклянная посуда (матрацы, флаконы, пробирки и т. д.) широко используются в микробиологической лаборатории как для выращивания микробов на питательных средах, так и для других целей. Перед использованием посуду необходимо соответствующим образом подготовить. С этой целью бывшую в употреблении посуду стерилизуют, моют теплой водой с помощью ерша или щетки, после чего ополаскивают 2— 3 раза дистиллированной водой и сушат.
Если обычному мытью посуда поддается с трудом, ее обрабатывают в течение 30 минут хромовой смесью (на 1 л воды 50 г двухромовокислого калия, 100 г технической серной кислоты), после чего хорошо промывают водой.
Посуду со следами агара, желатины и других питательных сред можно замачивать за сутки перед мытьем в растворе щелока. Для обесцвечивания неотмывшейся краски употребляют 3% раствор хлорной извести.
Посуду, применяемую для питательных сред, нельзя обрабатывать дезинфицирующими веществами. Примесь последних делает питательную среду непригодной.
Сушить посуду следует в сушильном шкафу, или в комнате-сушилке с температурой до 50° и хорошей вентиляцией.
Ватные пробки. Сухие пробирки, колбы, флаконы, бутыли закрывают ватными пробками, которые готовят следующим образом. Кладут на стол продолговатую четырехугольную пластинку ваты соответствующей величины, загибают внутрь все четыре края (рис. 25) так, чтобы получилась ленточка, по ширине равная длине пробки, и скатывают валик по диаметру пробирки или колбы. Ватную пробку можно обертывать кусочком марли в один слой. Концы марли связывают снаружи над пробкой ниткой. В настоящее время выпускаются специальные машины-станки для изготовления ватных пробок.
Физиологический раствор. На 1 л дистиллированной воды берут 8,5 г поваренной соли, растворяют при кипячении, остужают, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут.
Пользование пипетками. В микробиологической лаборатории широко пользуются пипетками. Пипетки бывают пастеровские и градуированные. Первые не имеют делений, и расчет жидкости при работе с ними ведется на капли- вторые имеют деления, и количество вытекающей из них жидкости определяется в миллилитрах, десятых долях миллилитра и т. д. Один конец пипетки широкий, другой — узкий. Для регулирования вытекающей жидкости широкий конец пипетки закрывают указательным пальцем и приоткрывают лишь настолько, чтобы вытекание происходило медленно. Пипетки затыкают ватой с того конца, который берут в рот. Комочек ваты не должен быть очень плотным, но и не должен свободно двигаться в пипетке. Волокна ваты не должны торчать из-за края пипетки, так как они не дадут возможности плотно зажать последнюю пальцем. Выступающие кусочки ваты можно сжечь на пламени горелки. Пипетки по одной или несколько штук завертывают в бумагу и стерилизуют. При работе с заразным материалом на верхний (широкий) конец пипетки нередко дополнительно надевают резиновую трубку или грушу, через которую и производят насасывание.
Рис. 25. Скатывание ватной пробки.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ И ЕЕ ВИДЫ
Полное освобождение данного предмета, материала, питательной среды от всех без исключения микробов называется стерилизацией (обеспложиванием). Понятие «стерилизация» шире понятия «дезинфекция», так как при последней имеют в виду уничтожение только патогенных микробов. Различают следующие виды стерилизации: 1) стерилизация высокой температурой- 2) механическая стерилизация.
- Стерилизация высокой температурой осуществляется различными способами:
а) прокаливание на пламени горелки — наиболее быстрый и верный способ стерилизации, но имеет ограниченное применение, так как большинство предметов от прокаливания портится. Прокаливанием стерилизуют платиновые петли, иглы, шпатели и мелкие металлические и стеклянные предметы, например пинцеты, предметные стекла, пипетки и т. д.-
б) кипячение — простейший способ стерилизации. Кипячением в течение 30 минут стерилизуют шприцы, хирургические инструменты и т. п. Прибавление к воде 1% соды предохраняет инструменты от ржавения и в то же время повышает надежность стерилизации. Однако этот способ не абсолютно надежен, так как споры некоторых бактерий могут сохраняться и при длительном кипячении-
в) стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха. Этот аппарат (рис. 26) представляет собой жестяной цилиндр с двойными стенками, прикрытый сверху конической крышкой. Для уменьшения теплоотдачи аппарат снаружи обшит войлоком или асбестом. В крышке имеется отверстие, куда вставляют термометр. Внутри аппарата имеется жестяное, свободно вынимаемое ведерко (для стерилизуемого материала), стенки и дно которого снабжены отверстиями.
На внутренней стороне цилиндра на различной высоте имеются выступы, на которые кладут продырявленные жестяные круги. На дно аппарата наливают воду, ставят в аппарат предметы, подлежащие стерилизации, и подогревают его, пока из верхнего отверстия не пойдет сильная струя пара- при этом температура внутри аппарата станет равной 100°. Нагревание при 100° продолжают от 30 до 60 минут. Для большей надежности, а также для стерилизации некоторых материалов, изменяющих свои свойства при длительном действии высокой температуры (желатина, сахар и некоторые другие), такое нагревание обычно производят 3 дня подряд по 30—60 минут (дробная стерилизация). При первом нагревании вегетативные формы микробов будут убиты, но могут сохраниться споры. До следующего дня споры прорастают и превращаются в вегетативные формы, особенно если стерилизуемый предмет остается в течение суток при температуре не ниже 20—22°. Последующим нагреванием убиваются эти вновь появившиеся вегетативные формы. Так как возможно, что некоторая часть спор не успела прорасти, материал выдерживают еще 24 часа при комнатной температуре, а затем проводят третью стерилизацию.
Рис. 26. Аппарат Коха для стерилизации текучим паром.
Рис. 27. Автоклав вертикальный.
Итак, правило стерилизации в аппарате Коха: 3 дня подряд по 30—60 минут-
г) стерилизация паром под давлением производится в автоклаве (рис. 27 и 28), который построен по принципу папинова котла. Автоклав впервые введен в практику нашим соотечественником Гейденрейхом в 1884 г. Он состоит из массивного цилиндрического медного котла, снабженного обшивкой из листового железа. Котел закрывается герметически металлической крышкой, плотно привинчивающейся винтами. На крышке, а иногда в стенке автоклава (в зависимости от конструкции) имеется несколько отверстий: для манометра, предохранительного клапана и выпускного крана для пара.
Внутри медного котла вставлен другой котел так, что между ними остается свободное пространство. Между котлами наливают воду через воронку, вставленную в водомерную трубку. Водомерная трубка укреплена в стенке котла. Уровень воды в автоклаве и водомерной трубке устанавливается на одной высоте по закону сообщающихся сосудов. У верхнего края котла межстенное пространство при помощи ряда отверстий сообщается с внутренним котлом. Пар поднимается между стенками котлов через верхние отверстия, проходит в стерилизационное пространство и через стерилизуемый материал, затем выходит через выпускной кран.
Рис. 28. Автоклав горизонтальный.
Стерилизацию в автоклаве осуществляют следующим образом. В автоклав наливают воду. Предметы, подлежащие стерилизации (биксы, питательные среды и т. д.), устанавливают внутри котла, завинчивают крышку, открывают до отказа выпускной кран и подогревают воду. Когда вода нагреется, из крана начинает выходить пар вместе с воздухом. Необходимо, чтобы весь воздух был вытеснен паром, так как в противном случае показания манометра не будут соответствовать температуре. Когда температура внутри котла достигнет 100°, из крана начнет бить струя пара. Когда пар вытеснит весь воздух из автоклава, он пойдет через паровой кран полной свистящей струей, не содержащей влаги (сухой пар). Тогда кран закрывают. Образующийся пар не выходит наружу, а поступает в замкнутое пространство и, скапливаясь во все большем количестве, повышает давление, а вместе с тем и температуру, о чем свидетельствуют показания манометра и термометра. При давлении 2 атм. (учитывая нормальное давление) температура будет равна 120°, при Давлении 3 атм.—134°. Когда давление достигнет нужных показаний (обычно 2 атм.) начинают регулировать нагревание, удерживая давление на этой высоте в течение 20—30 минут, затем прекращают нагревание и ждут, когда стрелка манометра упадет до нуля. Осторожно выпускают пар, открывают крышку и вынимают материал.
Рис. 30. Аппарат для стерилизации горячим воздухом.
Рис. 29. Печь Пастера.
Если стерилизуют жидкости, кран не следует открывать раньше, чем стрелка манометра дойдет до нуля. В противном случае вследствие быстрого падения давления жидкость вскипит, «выбросит» ватные пробки и сама выплеснется из сосудов. Для контроля действия автоклава пользуются различными веществами, имеющими определенную точку плавления, например бензонафтолом,— температура плавления 110°, антипирином —113°, резорцином и серой — 119° и бензойной кислотой —120°. При испытании в стеклянную трубочку длиной 5— 6 см, запаянную с одного конца, насыпают одно из перечисленных выше веществ, прибавляют немного сухой анилиновой краски (фуксин, сафранин, бриллиантгрюн и др.) и трубочку запаивают. Трубочку с порошком помещают в автоклав между стерилизуемыми предметами. Если температура достаточна, вещество расплавится и ярко окрасится в цвет, соответствующий взятой краске-
д) стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера (рис. 29), которая представляет собой жестяной шкаф с двойными стенками, снаружи обшитый асбестом с электронагревательным прибором. Нагретый воздух циркулирует в пространстве между двойными стенками и выходит наружу через одно или через ряд специальных отверстий. Горячий воздух нагревает предметы, находящиеся в шкафу. Стерилизация сухим жаром должна длиться 1 час при 160° или 3/4 часа при 165—170°. Контроль за температурой проводится по показаниям термометра. Начало стерилизации отсчитывается от того момента, когда термометр показывает 160—165°.
В выпускаемых в настоящее время электрических аппаратах, разнообразных по форме и снабженных хорошей тепловой изоляцией, необходимая температура поддерживается автоматически, при помощи терморегулятора, работу которого наблюдают по контрольной лампочке (рис. 30).
Обеспложиванию в пастеровской печи подвергаются вся стеклянная посуда, пастеровские пипетки, бумага и вата в маленьких пакетах. Подлежащие стерилизации сухие пробирки и колбочки закрывают ватными пробками, чтобы после стерилизации бактерии из воздуха не попали внутрь. Чашки Гейденрейха по одной или несколько заворачивают в бумагу- так же поступают с пипетками и воронками-
е) тиндализация применяется для обеспложивания веществ, Изменяющихся под действием температуры 100°. Такие объекты подвергаются прогреванию в течение 5 дней подряд по 1 часу при температуре 56—58°. Тиндализация производится или на водяной бане или в специальных приборах-
ж) пастеризация — стерилизация при 60—70°, введенная Пастером для уничтожения бесспоровых микробов в таких жидкостях, которые изменяются и портятся при более высоких температурах (вино, пиво, молоко). Широко применяется пастеризация молока, так как такая стерилизация при температуре не выше 65° сохраняет его вкусовые и питательные свойства.
Аппарат для свертывания сыворотки. Аппарат представляет собой жестяной ящик с двойными стенками, между которыми налита вода (рис. 31). Дно в этом аппарате скошенное, чтобы пробирки можно было положить в наклонном положении. Снаружи он обшит асбестом и закрывается двумя крышками—стеклянной, чтобы можно было наблюдать процесс свертывания среды, и сверху — металлической. В верхней части ящика имеется отверстие, через которое наливают воду. Воду в аппарате нагревают до температуры 80— 90° газовой горелкой или электрическим прибором. При данной температуре прогревание производят по 1 часу 3 дня подряд.
Рис. 32. Фильтр Зейтца.
Рис. 31. Аппарат для свертывания сыворотки.
Этим аппаратом пользуются для свертывания сыворотки, а также для приготовления ряда яичных питательных сред, причем одновременно с затвердеванием среды происходит ее стерилизация.
- Механическая стерилизация. Механическая стерилизация достигается при помощи бактериальных фильтров, приготовленных из мелкопористого материала. Микробы не могут проникнуть через эти поры. Имеются разнообразные бактериальные фильтры. Чаще всего пользуются фильтром Зейтца (рис. 32) и мембранными фильтрами.
Фильтры Зейтца состоят из пластинчатых асбестовых кружочков различной величины, вставляемых в специальные металлические держатели.
Для фильтрования каждый фильтр должен быть специально смонтирован — прилажен к приемнику, в который собирается фильтрат. Приемниками могут служить стеклянные цилиндры с боковым тубусом и расширенным наподобие воронки дном. Через тубус производят выкачивание воздуха водоструйным или другим насосом. В качестве приемника применяют также плоскодонные конические сосуды с боковым тубусом в верхней части, через который выкачивают воздух.
Для монтирования пластинчатых фильтров Зейтца имеются металлические держатели. Они изготавляются из никелированного металла и состоят из двух частей— верхней цилиндрической без дна и нижней, являющейся дном аппарата и привинчивающейся особыми винтами. Это дно в середине суживается в узкий тубус, служащий для стока фильтрата. Между обеими частями туго зажимают асбестовую пластинку, накладывающуюся на металлическую сетку, которая служит ей опорой. Всю установку стерилизуют в автоклаве.
После стерилизации места соприкосновения пробки с приемником и тубусом должны быть плотно соединены и залиты парафином.
Мембранные фильтры представляют собой пористые нитроцеллюлозные пленки в форме кружков диаметром 35 мм, толщиной 0,1 мм и напоминают тонкую белую бумагу. По размеру пор различают крупнопористые и мелкопористые фильтры. В зависимости от водопроницаемости различают следующие фильтры: № 1, 2, 3, 4 и 5. Самый плотный фильтр — № 1, самый рыхлый — № 5.
Кроме этих фильтров, выпускается так называемый предварительный фильтр, назначением которого является очистка воды от грубовзвешенных частиц. Самый распространенный в практике фильтр № 3 с диаметром пор 0,7 мк (техника пользования мембранными фильтрами описана на стр. 436 в разделе «Посев воды на мембранных фильтрах»).
