Микроскопия - микробиология с техникой микробиологических исследований
Фазово-контрастная микроскопия
Фазово-констрастный микроскоп значительно повышает контрастность объектов, проницаемых для света, и в медицине используется для изучения нативных препаратов.
Окрашенные препараты частично поглощают свет. Пучок света, проходящий через такой препарат, теряет в своей интенсивности, т. е. уменьшается амплитуда световой волны, и это легко улавливается глазом исследователя. Такие препараты контрастны даже в обычном микроскопе и называются «амплитудными». Препараты, не поглощающие света, прозрачны. Пучок света, проходящий через такой препарат, не теряет своей интенсивности. Амплитуда световой волны остается прежней, а изменяется лишь фаза колебания, что не регистрируется человеческим глазом. Такие объекты называются фазовыми. К ним относятся живые неокрашенные препараты. Чтобы повысить контрастность изображения, необходимо превратить фазовые изменения в амплитудные. Это достигается путем помещения в объективы фазовой пластинки в форме кольца и применением кольцевой диафрагмы. Каждому объективу соответствует своя кольцевая диафрагма. Изображение этой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива. Метод фазовых контрастов может быть положительным и отрицательным. В первом случае на светлом фоне поля наблюдается темное изображение объекта, а во втором — фон темный, а объект светлый. Наилучшие результаты наблюдаются в случае положительного фазового контраста.
Люминесцентная микроскопия
Люминесценция, т. е. свечение вещества, возникает в результате превращения энергии, поглощаемой веществом, в видимое излучение. Разница между микроскопией в проходящем свете и флюоресценцией заключается в том, что в последнем случае препарат рассматривается в излучаемом им свете. При этом химический состав клеток и тканей влияет на качество люминесценции и люминесцентная микроскопия в определенной мере является гистохимическим исследованием. Существует первичная и вторичная флюоресценция. При первичной флюоресценции в самом объекте находятся вещества, способные флюоресцировать. Вторичная флюоресценция— наведенная — возникает при специальной обработке веществами, способными флюоресцировать. Эти вещества называются флюорохромами (акридин оранжевый, флюоресцеин, родамин и др.).
Для люминесцентной микроскопии применяются ряд устройств и микроскопов (МЛ-1, МУФ-2, ОИ-18 и др.).
Основной частью этих устройств является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового света, и система фильтров к нему.
Микроскопия микроорганизмов в окрашенном виде
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле готовят мазок, который затем высушивают, фиксируют и окрашивают.
а и б — петля, приготовленная неправильно- в — правильно приготовленная петля.
Подготовка стекол. Для бактериоскопического исследования необходимо употреблять чистые, хорошо обезжиренные стекла. Новые стекла промывают водой, вытирают, а затем обрабатывают смесью из равных частей спирта и эфира, опуская в эту смесь на 2—3 дня. После этого стекла вытирают или остаток на них смеси спирта с эфиром сжигают на огне. Старые стекла, уже бывшие в употреблении, опускают на 2 часа в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем хорошо промывают водой или кипятят в 2% растворе соды или в мыльной воде, промывают водой и смесью спирта с эфиром.
Приготовление пастеровской пипетки. Стеклянную трубку диаметром 5—6 мм вносят в пламя горелки, нагревают до размягчения стекла и, вынув из пламени, аккуратно растягивают, медленно разводя концы трубки в разные стороны.
Приготовление платиновой петли. Берут отрезок платиновой проволоки (10—12 см) и при помощи пинцета на одном конце делают загиб (как показано на рис. 13), затем вставляют в металлический петледержатель.
Приготовление мазка и фиксация препарата. На предметное стекло, обработанное вышеуказанным способом, наносятся микробы. Необходимо распределить их по стеклу возможно более тонким слоем, т. е. приготовить мазок. При приготовлении мазков из культур микробов соответствующий материал берут платиновой петлей (см. рис. 33 на стр 81) или пастеровской пипеткой. При этом необходимо каждый раз прокаливать петлю и прилегающую к ней часть ручки петледержателя или стеклянной палочки, на которой она укреплена. Пастеровские пипетки стерилизуют сухим жаром. Прежде чем касаться культуры, следует охладить петлю. Жидкий материал равномерно распределяют платиновой петлей по центру предметного стекла.
Рис. 14. Прибор для промывания препаратов.
Рис. 15. Пинцеты для стекол.
Для приготовления мазка из культуры микробов на твердой среде (агар, картофель) предварительно наносят на предметное стекло небольшую капельку воды, платиновой петлей вносят в эту каплю небольшое количество исследуемой культуры, размешивают и распределяют тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок сушат на воздухе и фиксируют, чем достигается умерщвление микробов и прочное прикрепление их к стеклу. Фиксацию производят троекратным проведением препарата через пламя горелки (мазком вверх). Проведение препарата над пламенем горелки должно быть умеренной скорости. Фиксация может быть произведена и другими методами, например действием метилового спирта, смеси этилового спирта с эфиром и др. Фиксация резко улучшает окрашиваемость микробов, которые в живом виде слабо воспринимают краски.
