Питательные среды - микробиология с техникой микробиологических исследований
Для решения основных задач бактериологического исследования (выделение чистых культур бактерий, определение их биологических свойств и т. д.) необходимо уметь выращивать микробов в лабораторных условиях. Это осуществляется на питательных средах. Правильно приготовленные питательные среды определяют успех работы лаборанта-микробиолога.
В состав питательных сред должны входить:
- Вещества, необходимые для роста и размножения, а также для построения бактериальной клетки: источники азота, углерода, кислорода и водорода.
- Неорганические соединения в виде различных солей.
- Бактериальные витамины, или так называемые факторы роста.
Помимо этого, питательные среды должны иметь определенную вязкость, влажность и реакцию среды. Микробы приспосабливаются к некоторым колебаниям этой реакции, но для каждого микроба имеются границы, пределы которых эти колебания не должны переходить.
В микробиологической практике существует много самых разнообразных питательных сред. В зависимости от их свойства, состава и назначения питательные среды можно разделить на несколько групп.
По происхождению различают: а) естественные питательные среды и б) искусственные питательные среды.
К первым относятся сыворотка крови, желчь, яйца, молоко, картофель, морковь. Ко вторым — питательные среды, приготовленные из мясных или растительных настоек, к которым добавляют различные азотистые продукты, углеводы и соли, например мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар и т. д.
По консистенции среды разделяют на плотные, полужидкие и жидкие. К плотным средам относится мясо-пептонный агар, питательная желатина, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок, картофель и др. Полужидкой питательной средой является 0,5% мясо-пептонный агар. К жидким средам относится мясопептонный бульон, пептонная вода, сахарный бульон и др.
По составу все питательные среды могут быть разделены на три группы:
- среды основные, или простые, употребляемые для выращивания большинства патогенных микробов (мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, мясопептонная желатина и др.);
- среды специальные, или элективные, применяемые для выделения и выращивания определенных патогенных бактерий, которые на обычных средах плохо или совсем не растут (сахарный бульон, желчный бульон, агар с кровью и др.);
- среды дифференциально-диагностические, служащие одним из вспомогательных средств при определении (идентификации) чистой культуры исследуемого микроорганизма (углеводы пестрого ряда Гисса, агар Эндо и др.).
Видео: Питательные среды для медицинской микробиологии. Часть 2.
Приготовление питательных сред
Основные питательные среды
Наиболее распространенной жидкой средой является мясо-пептонный бульон. Он готовится на мясной воде.
Мясная вода. Мелко нарубленное мясо, освобожденное от жира и сухожилий, смешивают с двойным по весу количеством воды (500 г+1 л воды), настаивают 24 часа при комнатной температуре, фильтруют через кусок полотна и тщательно отжимают мясо, оставшееся на нем. Мясная вода представляет собой красноватую жидкость кислой реакции. Она содержит растворимые белковые вещества (альбумины), экстрактивные вещества и некоторые соли. Мясную воду кипятят до свертывания белка и фильтруют через бумажный фильтр. При необходимости сохранить мясную воду ее разливают по флаконам или бутылкам и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут (см. стр. 74). В настоящее время также широко применяется способ горячей экстракции фарша без замачивания его в холодной воде. Мясной фарш с водой прогревают 1/2 часа, не доводя до кипения, а затем уже кипятят 1 час. Этим методом лучше пользоваться в летнее время.
Приготовление мясо-пептонного бульона. Бульон готовят из мясной воды, к которой для повышения питательных свойств прибавляют пептон (1%) и хлористый натрий (0,5%), т. е. на 1 л мясной воды берут 10 г пептона и 5 г хлорида натрия. Смесь кипятят 10—15 минут при постоянном помешивании. При этом пептон и соль растворяются. Полученный бульон имеет кислую реакцию, при которой большинство патогенных микробов не дает роста. Необходимо поэтому сделать реакцию слабо щелочной.
Для установления реакции необходимо иметь растворы индикаторов и титрованные растворы щелочей и кислот. В бактериологии употребляют различные индикаторы, т. е. вещества, цвет которых меняется в зависимости от реакции среды, например лакмус, фенолфталеин, мета-нитрофенол, пара-нитрофенол и др. Лакмус чаще всего используется в виде лакмусовой бумажки, фенолфталеин — в виде 0,5% спиртового раствора, метанитрофенол— в виде 0,3% водного раствора (на дистиллированной воде) и пара-нитрофенол — в виде 0,1% водного раствора, кислоты и щелочи — в виде нормальных растворов. После установления реакции бульон кипятят, фильтруют и стерилизуют.
Установление реакции питательной среды. В настоящее время общеупотребительным способом определения реакции среды является колориметрический метод Михаэлиса. Сущность метода основана на изменении цвета индикатора в зависимости от степени его диссоциации. Последнее обусловлено концентрацией водородных ионов исследуемой жидкости.
Нейтральной реакции соответствует pH 7,0- рН<7,0 обозначает кислую реакцию, рН>7,0 — щелочную реакцию. Для колориметрического метода нужно иметь наготове большее количество различных кислых и щелочных растворов, активная реакция которых (pH) заранее определена электрометрическим путем. Эти стандартные растворы должны быть подобраны так, чтобы получилась целая шкала с постепенно нарастающей щелочностью (pH): 5,0- 5,2- 5,4- 5,6 и т. д. Обычно Для определения pH пользуются стандартными растворами в запаянных пробирках, которые установлены рядами в специальном ящике с крышкой.
Рис. 22. Компаратор Михаэлиса (объяснение в тексте).
Чтобы определить pH, пользуются компаратором, который представляет собой деревянную колодку, на верхней поверхности которой имеется б отверстий (по 3 в два ряда) такого же размера, как и применяемые пробирки. Пробирки на половину своей длины входят в блок, как в обычный штатив. Боковые поверхности компаратора гладкие, а на передней и задней стенке имеются сквозные отверстия, через которые проходит свет. На задней стенке против отверстий вставлены матовые (молочные) и синие стекла (рис. 22).
Определение реакции питательной среды производится следующим образом. В отверстие 2 компаратора вставляют пробирку с 2 мл питательной среды, в которую прибавляют 4 мл дистиллированной воды и 1 мл индикатора (мета- или пара-нитрофенола), в отверстие 5 — пробирку с дистиллированной водой. В отверствия 1 и 3 вставляют пробирки, содержащие 2 мл той же питательной среды с 5 мл дистиллированной воды (без индикатора). В отверстия 4 и 6 ставят стандартные пробирки с такими показателями pH, между которыми хотят установить реакцию среды. Во 2-й или 1-й или 2-й и 3-й пробирках при наблюдении в проходящем свете через отверстия в боковых стенках компаратора должны получиться совершенно одинаковые оттенки цвета жидкости. Реакция среды будет соответствовать реакции стандарта, с которым она по цвету совпадает. Если во 2-й пробирке цвет окажется более светлым, чем в стандартной, то в нее по каплям прибавляют деци-
нормальный раствор щелочи, пока окраска не станет одинаковой со стандартной. Затем рассчитывают количество щелочи, необходимое для установления реакции 1 л среды, исходя из количества щелочи, прибавленной к 2 мл бульона.
Пример. Необходимо установить в исследуемой среде pH 7,4. В отверстия 4 и 6 вставляют стандартные пробирки с обозначением pH 7,4 и 7,6. В пробирку, вставленную в отверстие 2, приливают по каплям из градуированной пипетки децинормальный раствор едкого натра до тех пор, пока не получится оттенок, отвечающий стандарту с нужным pH. Если для установления pH в 2 мл среды потребовалось 0,2 мл децинормального раствора едкого натра, то для 1 л потребуется 0,2 X500=100 мл децинормального или 10 мл нормального раствора едкого натра. Так как при стерилизации среды pH часто изменяется в сторону уменьшения щелочности, то перед стерилизацией следует установить pH немного выше требуемого (на 0,2). Плотные питательные среды расплавляются перед определением pH. Определение ведется, как указано выше.
В последнее время выпущен в продажу прибор Михаэлиса для определения pH среды микрометодом.
Приготовление мясо-пептонного агара. К мясо-пептонному бульону прибавляют от 2 до 4% (в зависимости от сорта) мелко нарезанного агар-агара и кипятят до полного растворения. Затем дают остыть до 50° и прибавляют для просветления яичный белок (на 1 л агар берут взбитый и размешанный с небольшим количеством воды белок одного яйца), хорошо взбалтывают и помещают на 4—5 минут в автоклав. Белок во время кипячения свертывается и увлекает за собой взвешенные частицы. Полученную мутную жидкость фильтруют в горячем виде через вату, смоченную горячей водой. Можно обойтись и без яичного белка, но агар получается недостаточно просветленным. Горячий профильтрованный агар разливают в пробирки по 5— 8 мл или в колбы по 50—500 мл и стерилизуют в автоклаве 20 минут при 120—125°. После стерилизации пробирки с еще жидким агаром следует положить почти горизонтально, чтобы агар застыл в скошенном положении с большой поверхностью, или дать ему застыть в виде столбика. В первом случае получится скошенный. агар, во втором — столбик (рис. 23). Скошенный агар Должен иметь на дне пробирки конденсационную воду, Необходимую для нормальной жизнедеятельности микробов.
Рис. 23. Пробирки с агаром столбиком и скошенным агаром.
М я с о-пептонная желатина. К 1 л мясной воды прибавляют 1 г пептона, 5 г поваренной соли и 100 или 150 г мелко нарезанной желатины. Оставляют стоять несколько часов, чтобы желатина разбухла. Полученную смесь подогревают до полного растворения желатины. Устанавливают слабощелочную реакцию, просветляют яичным белком, фильтруют через вату, смоченную кипятком. После разливки среду стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 60 минут каждый день. Стерилизовать желатину в автоклаве нельзя, так как она после этого теряет способность застывать. Желатина плавится при температуре 23—25° и снова застывает при температуре ниже 22°.
Питательные среды на переваре Хоттингера. Основной раствор Хоттингера с успехом заменяет мясную воду. Он готовится следующим образом. Нарезают небольшими кусочками 1 кг мяса, помещают в сосуд, содержащий 1,5 л кипящей воды и кипятят 15—20 минут. Затем мясо вылавливают и измельчают в мясорубке. Остывшую до 40—45° жидкость переливают в бутыль и прибавляют 1,5 г соды, 3—5 г панкреатина и 15—20 г хлороформа, тотчас же закрывают резиновой пробкой и встряхивают. К этой жидкости прибавляют измельченное мясо, желчь (20 мл желчи на 1 кг фарша), встряхивают и оставляют бутыль стоять при комнатной температуре на 5 суток или дольше (жидкость в бутыли ежедневно по нескольку раз в день взбалтывают), пока содержимое ее не превратится в прозрачную, насыщенно желтую жидкость с мелким осадком на дне. Достаточность переваривания определяют реакцией на триптофан. Затем жидкость фильтруют, разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут. Для приготовления бульона этот основной раствор разводят дистиллированной водой в 3—5 или 10 раз. Степень разведения зависит от того, для каких микроорганизмов предназначается данная среда, и от качества полученного раствора Хоттингера. К уже разведенному перевару Хоттингера прибавляют 0,7% хлорида натрия и 0,1 /о фосфорнокислого калия (К2НРО4), кипятят, устанавливают желаемую реакцию, снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, еще раз проверяют реакцию, разливают по пробиркам и флаконам и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут.
Растворяя в таком бульоне агар или желатину, получают соответствующую твердую среду.
Пептон Мартена и бульон из него. Берут свиные желудки, освобождают от жира и, не промывая, пропускают через мясорубку. Фарш опускают в бутылки по 250 г и заливают солянокислым раствором (1 л нагретой до 50° водопроводной воды+10 мл дымящей соляной кислоты). Смесь оставляют для переваривания в термостате при 45—50° до тех пор, пока фарш не превратится в порошковидную массу и не появится положительная реакция на триптофан. Переваривание обычно продолжается 48 часов. Полученный таким образом мартеновский пептон стерилизуют в тех же бутылях при давлении в 1 атм (сверх нормального).
Для приготовления бульона Мартена из бутыли отсасывают жидкость сифоном или пипеткой Мора большой емкости, фильтруют через вату и добавляют равный объем мясной воды. Затем устанавливают необходимую реакцию, бульон кипятят 30 минут, дают отстояться, после чего фильтруют через полотно или фильтровальную бумагу, разливают по пробиркам и колбам и окончательно стерилизуют при давлении 0,5 атм 30—40 минут.
Специальные питательные среды
Сахарный бульон и сахарный агар готовят путем прибавления к обычному бульону или расплавленному простому агару того или иного углевода в количестве от 0,5 до 1%. Углевод растворяют в небольшом количестве воды, а затем прибавляют к питательной среде. Стерилизацию сахарного бульона и агара производят в аппарате Коха 3 дня подряд по 1 часу.
Агар с кровью, сывороткой или с асцитической жидкостью готовят при соблюдении строгой асептики. К готовому слабо-щелочному расплавленному и вновь охлажденному до 45° агару, разлитому в пробирки или флаконы, прибавляют 20—25% стерильной сыворотки или асцитической жидкости или 5—25% стерильной дефибринированной крови. После тщательного перемешивания (избегать образования пузырей и пены) агар в пробирках скашивают, а содержимое флаконов разливают по чашкам Гейденрейха.
Бульон с сывороткой, асцитической жидкостью или кровью готовят таким же способом, как агар, но без нагревания. Для контроля стерильности бульон ставят в термостат на 48 часов при 37°.
Среда Леффлера. Сыворотка получается из крови лошади, быка или барана. Три части полученной сыворотки смешивают с одной частью слабощелочного сахарного бульона (1% пептона, 0,5% хлорида натрия и 1% глюкозы) и разливают в пробирки по 8 мл. Пробирки помещают в специальный аппарат для свертывания в наклонном положении и нагревают по 1 часу при 80—90° в течение 3 дней. При этом сыворотка свертывается. Для контроля стерильности пробирки ставят на 48 часов в термостат при 37°. Таким же образом готовят пробирки со свернутой лошадиной сывороткой, не разведенной бульоном (среда Ру). Нагревание нужно производить медленно во избежание образования пузырей. Среда применяется для выделения дифтерийной палочки.
Дифференциально-диагностические среды.
Среда Эндо. Готовится непосредственно перед употреблением. К ЮО мл мясо-пептонного агара или агара на бульоне Хоттингера (pH 7,6) стерильно добавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, охлаждают до 70° и добавляют смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина и 1,25 мл свежеприготовленного 10% раствора сернистокислого натрия, взбалтывают и разливают по чашкам. Для подсушивания открытые чашки помещают на 30 минут в термостат при 37°.
На среде Эндо кишечная палочка дает колонии красного цвета с металлическим оттенком, а бактерии тифозно-паратифозной и дизентерийной группы — бесцветные колонии (см. рис. 77 на вклейке).
Пестрый ряд углеводов (среда Гисса). К ЮО мл воды прибавляют 1 г пептона, 0,5 г поваренной соли. Пептон и соль растворяют в горячей воде в течение нескольких минут и фильтруют через бумажный фильтр (раствор должен быть совершенно прозрачным). Устанавливают pH 7,0. В указанной среде растворяют 1% одного из применяемых углеводов, на дно пробирок опускают поплавки для улавливания газа (свидетельствующего о глубоком расщеплении сахаров) и прибавляют индикатор. В качестве индикатора употребляют:
а) лакмусовую настойку — 5 мл на 100 мл среды. В кислой среде лакмусовая настойка показывает покраснение, в щелочной — посинение- б) азолитмин, который представляет собой очищенный препарат лакмуса, его калийную соль (на 1 л среды добавляют 0,25 г азолитмина)- в) бромтимолблау — на 1 л среды 1 мл 1,6% спиртового раствора индикатора (среда приобретает зеленый цвет, синеет при образовании щелочи, желтеет при образовании кислоты)- г) индикатор Андреде, который состоит из 1 г кислого фуксина, 400 мл дистиллированной воды и 64 мл нормального раствора едкого натра. К питательной среде добавляют 1% индикатора. Среда в пробирке должна приобрести соломенно-желтый цвет без розового оттенка. В кислой среде цвет среды меняется на красный (рис. 24 на вклейке).
Индикатор добавляют для того, чтобы определить изменения реакции питательной среды, происходящей под влиянием ферментации углеводов, т. е. для выявления биохимической активности микробов. Последнее имеет большое значение для микробиологической диагностики ряда инфекционных заболеваний (брюшной тиф, дизентерия, холера и др.). Среды с углеводами и индикатором разливают в стерильные пробирки и стерилизуют дробно при 100° в течение 3 дней.
Видео: посев воды на микробы
Сухие питательные среды
Применение сухих питательных сред приобретает все большее практическое значение. Стандартность, простота хранения, транспортировки и изготовления делают сухие питательные среды весьма удобными для работы.
Сухие питательные среды представляют собой светло-желтые гигроскопические порошки без комков, с влажностью до 10%. В сухом месте, в хорошо закупоренной посуде их можно хранить длительное время. Они должны хорошо растворяться в дистиллированной воде при комнатной температуре в концентрации 1,5—6%.
Сухой питательный бульон. 25 г порошка растворяют в 1 л холодной дистиллированной воды при подогревании, разливают и стерилизуют. После стерилизации при 120° в течение 15— 20 минут получают прозрачный, без осадка раствор бледно-желтого цвета с нейтральным pH. Из сухого питательного бульона можно готовить бульон, дифференциальные среды с углеводами, питательный агар и твердые дифференциальные среды.
Сухой питательный агар. К 1 л дистиллированной воды добавляют 50 г порошка, расплавляют, устанавливают необходимую реакцию, пропускают через ватно-марлевый фильтр, разливают, стерилизуют при 120° в течение 25—30 минут.
Сухой агар Эндо. 5 г порошка светло-сиреневого цвета (быстро портящегося под влиянием света) всыпают в 100 мл холодной дистиллированной воды, затем расплавляют, кипятят в течение 5 минут. После охлаждения до 50° массу взбалтывают (для равномерного распределения осадка) и разливают в чашки.
Среды Гисса с углеводами и индикатором ВР.
1 г порошка всыпают в 100 мл холодной дистиллированной воды, подогревают до растворения, разливают в стерильные пробирки с поплавками, стерилизуют 5 минут при 110° (согласно инструкции). Выпущена и вторая модификация этой среды — полужидкая (разливать без поплавков). Среды после стерилизации и остывания имеют желтовато-розовый или бледно-розовый цвет. Жидкая среда прозрачная, полужидкая с опалесценцией. Индикатор ВР представляет собой смесь розоловой кислоты и водной голубой краски. В кислой среде индикатор имеет интенсивно синий цвет, в щелочной — от слабо-розового до красного.
Сухая желчь. 7 г порошка растворяют в 100 мл воды, разливают, стерилизуют в автоклаве. Употребляют как среду обогащения при выделении бактерий из крови при брюшном тифе и паратифах.
Сухая среда Леффлера. 100 г порошка растирают в ступке с небольшим количеством теплой воды до получения однородной массы, добавляют теплой воды до 1 л, фильтруют через два слоя марли, разливают по пробиркам, стерилизуют в свертывателе Коха в течение 3 дней при 90° по 1 часу.
Сухая молочная сыворотка с индикатором ВР. 1 г порошка серовато-сиреневого цвета всыпают в 100 мл холодной дистиллированной воды, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром в течение 20 минут. Среда аметистового цвета. Палочки брюшного тифа и дизентерии не изменяют цвета среды. При росте Е. coli среда резко синеет. Бактерии паратифа В окрашивают среду в голубой цвет.
Фильтрование и разливка питательных сред
Жидкие питательные среды и расплавленную желатину фильтруют либо через складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, предварительно смоченной водой, либо через фильтровальное полотно, накладываемое на стеклянную воронку. Практичнее пользоваться полотняными фильтрами, ибо они могут служить долгое время, тогда как бумажные фильтры употребляются лишь однократно. Для фильтрования агаровых сред применяют ватно-марлевый фильтр. Агар наливают на фильтр горячим. После фильтрования питательные среды разливают в посуду (флаконы, пробирки).
Для разливки питательных сред в пробирки пользуются воронкой или бюреткой, на нижний конец которой надета короткая резиновая трубка с маленьким стеклянным наконечником и зажимом Мора.
